司麗娜，吳迪，蘇瑋，魏萌，楊旭慶，陳磊，楊松鶴，程露陽，喬躍兵，4

(1承德醫(yī)學院，河北承德067000；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院；3陸軍總醫(yī)院263臨床部；4滄州醫(yī)學高等專科學校)

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側腦室注射微量GnIH大鼠的血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織POMC蛋白表達觀察

司麗娜1，吳迪2，蘇瑋3，魏萌1，楊旭慶1，陳磊1，楊松鶴1，程露陽1，喬躍兵1，4

(1承德醫(yī)學院，河北承德067000；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院；3陸軍總醫(yī)院263臨床部；4滄州醫(yī)學高等專科學校)

目的 觀察側腦室微量注射促性腺激素抑制激素(GnIH)后雄性大鼠血漿促性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)水平變化，及下丘腦組織中阿片促黑素細胞皮質素原(POMC)蛋白的表達變化。方法 雄性SD大鼠60只，隨機分為實驗組和對照組各30只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實驗組于大鼠側腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內注射完畢，留針10 min。對照組給予等量生理鹽水。兩組分別于注射后60、120、240 min各取10只大鼠心房取血，采用ELISA法檢測血漿GnRH、FSH；心房取血后斷頭處死大鼠，取下丘腦組織，采用Western blotting法檢測下丘腦組織中的POMC蛋白。結果 實驗組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對照組(P均<0.05)，實驗組內注射后不同時點差異無統(tǒng)計學意義。實驗組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于對照組，且實驗組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。結論 側腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平降低，下丘腦組織中POMC蛋白表達下調。GnIH對下丘腦-垂體-性腺軸有一定調節(jié)作用，其機制可能與抑制POMC神經元功能有關。

促性腺激素抑制激素；促性腺激素釋放激素；卵泡刺激素；阿片促黑素細胞皮質素原；下丘腦-垂體-性腺軸

哺乳動物的生殖功能主要依賴于下丘腦、垂體和性腺通過自分泌和旁分泌方式所分泌的各種激素進行調控，此神經內分泌調節(jié)體系即為下丘腦-垂體-性腺軸。下丘腦以脈沖方式合成并分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)。GnRH在生殖內分泌的調控中起到核心作用，其可以興奮或抑制下丘腦及其他一些神經元產生效應。很多學者認為下丘腦分泌GnRH是生殖功能調控的惟一途徑，而促性腺激素抑制激素(GnIH)的發(fā)現改變了人們對神經內分泌生殖軸的認識。GnIH是一種由日本鵪鶉腦中分離純化的新型神經肽[1]，GnIH可通過其受體G蛋白耦聯(lián)受體147(GPR147)作用于垂體和下丘腦的GnRH神經元，抑制促性腺激素釋放和合成[2]，但具體作用機制還沒有明確報道。雖然在GnRH神經元上有GnIH受體表達，但鑒于GnIH的多效性，不排除它可以通過投射到其他神經元而間接影響GnRH分泌。阿片促黑素細胞皮質素原(POMC)是一種很強的抑制食欲因子，在調節(jié)攝食能量平衡和生殖方面發(fā)揮重要作用。但是POMC神經元是如何調節(jié)生殖功能的，是直接還是間接作用于GnRH神經元，說法不一。有研究觀察到POMC神經元與GnIH神經元之間存在突觸聯(lián)系，而有學者則否認這種聯(lián)系的存在。因此，本研究觀察了側腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平變化，及下丘腦組織中POMC蛋白表達變化，以此探討GnIH對HPG軸的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康成年雄性SD大鼠60只購自北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證號11401300016009)，體質量220～250 g，飼養(yǎng)于實驗動物中心，室溫維持25 ℃左右，通風良好，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)兩周后用于實驗，隨機分為實驗組和對照組各30只。酶標儀購自美國Thermo公司，大鼠的腦立體定位儀購自日本Narishige公司，大鼠ELISA試劑盒(GnRH、FSH)購自上海酶連生物有限公司，蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，GnIH購自美國Peprotech公司，POMC與GAPDH均購自Bioworld公司，二抗(山羊抗兔IgG)購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 GnIH給藥方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實驗組于大鼠側腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內注射完畢，留針10 min。對照組給予等量生理鹽水。

1.3 血漿GnRH、FSH檢測 在麻醉狀態(tài)下，兩組大鼠分別于側腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠開胸，快速自右心房采集靜脈血，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min后取其上清液，-80 ℃儲存。采用ELISA法檢測血漿GnRH、FSH。

1.4 下丘腦組織中POMC蛋白檢測 在麻醉狀態(tài)下，兩組大鼠分別于側腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠，心房采血后立即斷頭處死，取下丘腦組織，用PBS清洗，稱重。將下丘腦組織放入勻漿器并加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。用蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量，調整電泳上樣量。經SDS-PAGE電泳分離的蛋白電轉移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，加入一抗[兔抗POMC(1∶500)，兔抗CAPDH(1∶8 000)]4 ℃孵育過夜，洗膜3次后加入二抗[羊抗兔IgG(1∶4 000)]孵育2 h，洗膜3次，化學發(fā)光法顯色。掃描圖像后采用Image J軟件分析蛋白條帶的平均灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值之比代表POMC蛋白相對表達量。

2 結果

實驗組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對照組(P均<0.05)，實驗組內注射后不同時點差異無統(tǒng)計學意義。實驗組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于對照組，且實驗組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

GnIH及其同系肽(RFRP)分布于哺乳動物[3]、鳥類[4]、兩棲動物[5]和魚類[6]中。哺乳動物的GnIH神經元主要存在于下丘腦的室周核、背內側核、背內側核與下丘腦腹內側核中間的區(qū)域[3]。同時，大多數哺乳動物的垂體、間腦、端腦、視頂蓋等組織都能表達GnIH的內源受體GPR147。有研究[7]顯示GPR147在垂體的促黃體激素(LH)、促卵泡素(FSH)細胞中都有表達。哺乳動物的GnRH1神經元上也有GnIH受體的表達[3]，證明GnIH可能通過GnRH1神經元來抑制生殖功能。有學者認為GnIH通過抑制GnRH神經元進而抑制促黃體激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放[8]。GnIH及其受體可以在垂體水平抑制促性腺激素的合成與釋放[9]。此外，GnIH在性腺中也有表達[10,11]，這表明GnIH不僅能抑制促性腺激素的釋放，還可能通過某種方式調節(jié)性腺的發(fā)育。GnIH神經纖維可以投射到NPY神經元、POMC神經元、MCH神經元，這些神經元在控制攝食方面發(fā)揮著重要作用[12]。因此，GnIH可能通過與這些神經元相互作用，從而調控神經內分泌生殖系統(tǒng)。

表1 藥物注射后不同時點兩組大鼠血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量比較

注: 與同時點對照組相比，*P<0.05。

POMC神經元廣泛存在于無脊椎動物及所有脊椎動物的下丘腦中，是調節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的重要神經元[13]。POMC是在垂體、下丘腦弓狀核表達的一種含有267個氨基酸序列的神經肽，是腦內多種激素的前體，具有調節(jié)能量平衡和抑制食欲的重要作用[14]。有學者[15]在大鼠胚胎第12天的下丘腦中就發(fā)現POMC的表達，證實POMC神經元在下丘腦能量平衡調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。研究[16]發(fā)現GnIH能降低小鼠腦中POMC細胞的電生理功能，而POMC及其受體表達可提高GnRH神經元的活性[17]。由此推測，GnIH通過其受體可作用于GnRH神經元，可通過其神經纖維投射至POMC神經元，還可能通過POMC神經元間接作用于GnRH，進而影響生殖功能。

GnIH是神經內分泌調節(jié)的重要參與者，前期研究已證實GnIH受體存在GnRH神經元上，GnIH可直接作用于GnRH神經元發(fā)揮對生殖系統(tǒng)的抑制作用。但GnIH的多效性暗示其不只限于這一種作用途徑，它能進一步投射到腦部其他區(qū)域，與該區(qū)域的神經元相聯(lián)系并發(fā)揮作用[18]。由此，POMC神經元可能作為GnIH調節(jié)GnRH的一個中間神經元，影響GnIH神經元對下丘腦-垂體-性腺軸的調節(jié)作用。我們在側腦室微量注射GnIH后，觀察雄性大鼠GnRH、FSH水平變化，結果顯示側腦室微量注射GnIH后60、120、240 min大鼠血漿GnRH、FSH水平均降低，提示GnIH在一定時間內可抑制GnRH和FSH的分泌，此抑制作用在一定時間范圍內呈時間依賴性。GnIH可抑制下丘腦GnRH神經元的分泌作用，進而抑制垂體FSH的分泌，提示GnIH對下丘腦-垂體生殖軸有一定的抑制作用。本研究還發(fā)現側腦室微量注射GnIH 60、120、240 min后，實驗組下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量呈下降趨勢，且注射240 min后下丘腦組織中POMC蛋白相對表達量低于注射后60、120 min，表明GnIH在一定時間范圍內對大鼠下丘腦POMC分泌具有負反饋調節(jié)作用，可抑制POMC的分泌。本實驗提示GnIH可能通過抑制POMC神經元抑制下丘腦GnRH的釋放，進而抑制垂體促性腺素FSH的釋放，從而發(fā)揮對下丘腦-垂體生殖軸的調節(jié)作用。然而，GnIH神經元對POMC神經元的調節(jié)是直接作用還是間接作用，或是綜合作用的結果，還需要進一步研究來證明。本實驗受河北省高校人體解剖學與組織胚胎學重點發(fā)展學科建設項目資助、河北省高校病原生物學重點學科項目資助。

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河北省自然科學基金資助項目(H2013406115)；河北省科學技術研究與發(fā)展計劃項目(08276101D-20)；河北省高等學校科學研究項目(QN2015121)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究項目(20130021)。

喬躍兵(E-mail:qiaoyuebing@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.009

R-332

A

1002-266X(2017)27-0034-03

2017-03-23)