鮑 雷,肖 楊,蔡夏夏,王 楠,李 勇(.北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,北京 006; .北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 009)

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5′-核苷酸對(duì)慢性酒精中毒誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸功能損傷的影響

鮑 雷1,肖 楊1,蔡夏夏2,王 楠2,李 勇2
(1.北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,北京 102206; 2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191)

探討外源性5′-核苷酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸功能紊亂的保護(hù)作用。50只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、酒精模型組、等熱量對(duì)照組及0.04%、0.16%核苷酸組。連續(xù)酒精灌胃6周后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),外源性5′-核苷酸能夠有效改善酒精引起的大鼠結(jié)腸病理性改變,顯著提高結(jié)腸功能相關(guān)蛋白Claudin和Occludin的表達(dá)水平(p<0.01或p<0.05),極顯著降低大鼠結(jié)腸組織中Toll樣受體4(TLR4)和分化抗原簇14(CD14)的表達(dá)水平(p<0.01);外源性5′-核苷酸能夠顯著增加大鼠回腸內(nèi)容物中雙歧桿菌(酒精組8.00 log CFU/g,核苷酸組8.32 log CFU/g)和乳酸桿菌數(shù)量(酒精組7.44 log CFU/g,核苷酸組8.13 log CFU/g)(p<0.05),同時(shí)顯著減少腸球菌(酒精組7.52 log CFU/g,核苷酸組7.03 log CFU/g)及大腸桿菌數(shù)量(酒精組6.85 log CFU/g,核苷酸組6.19 log CFU/g)(p<0.05)。因此,外源性5′-核苷酸能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善酒精引起的大鼠結(jié)腸損傷。

5′-核苷酸,結(jié)腸功能,腸道菌群

近年來(lái),酒精攝入引起相關(guān)的健康問題逐漸受到人們的重視。2005年世界衛(wèi)生組織(WHO)明確指出,在全球范圍內(nèi)酒精導(dǎo)致4%的患病率和3.2%的死亡率,如酒精性肝病、慢性胰腺炎、胃炎、出血性卒中、高血壓、心臟病以及惡性腫瘤等[1]。長(zhǎng)期過量飲酒或飲用高度酒均會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生一定的不良影響,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致脂肪肝、肝硬變并損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心臟功能。目前關(guān)于酒精所致疾病的研究主要集中于酒精性肝病,但酒精性肝病的發(fā)病過程中伴隨著腸道屏障功能的變化[2]。酒精攝入可增加機(jī)體小腸黏膜通透性,引發(fā)腸道屏障功能障礙,促使腸源性內(nèi)毒素滲漏形成腸源性內(nèi)毒素血癥,從而進(jìn)一步加重肝臟損傷[3]。此外,有實(shí)驗(yàn)證實(shí)酒精對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胃腸道運(yùn)動(dòng)均有一定的抑制作用,長(zhǎng)期飲用可引起胃腸道粘膜表面發(fā)生病理性變化[4-7]。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在維持腸道屏障功能方面有重要作用,并且與酒精所致疾病密切相關(guān)[8]。核苷酸是由核苷與磷酸通過酯鍵結(jié)合構(gòu)成的生物分子,盡管核糖上的游離羥基(核糖的C-2′,C-3′,C-5′及脫氧核糖的C-3′,C-5′)均能與磷酸發(fā)生酯化反應(yīng),但生物體內(nèi)多數(shù)核苷酸的酯化反應(yīng)都是在C-5′原子上,都是屬于5′-核苷酸。5′-核苷酸具有多種生物學(xué)作用,如免疫調(diào)節(jié)作用,延緩衰老作用,抑制腫瘤,保護(hù)肝臟,并對(duì)胃腸道的生長(zhǎng)、修復(fù)和分化有重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn),5′-核苷酸能夠改善配方食品組嬰幼兒腸道菌群的組成,促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng),直接抑制擬桿菌屬-卟啉單胞菌屬-普氏菌屬的生長(zhǎng),因此,核苷酸補(bǔ)充具有直接的益生菌效應(yīng)[10]。目前有關(guān)核苷酸對(duì)酒精引起的結(jié)腸功能變化的相關(guān)研究未見報(bào)道。因此,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸功能的影響,并探討外源性5′-核苷酸的保護(hù)作用,為5′-核苷酸應(yīng)用于酒精性結(jié)腸損傷的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5′-核苷酸混合物(純度99%,5′AMP∶5′CMP∶5′GMPNa2∶5′UMPNa2=22.8-26.6-20.4-30.2) 大連珍奧生物工程股份有限公司;基礎(chǔ)飼料 美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)(American Institute of Nutrition,AIN-93G)純化飼料;添加核苷酸飼料配方 在AIN-93G純化飼料基礎(chǔ)上分別以0.4 g/kg和1.6 g/kg的比例添加核苷酸,北京華阜康生物科技股份有限公司;右旋糖(純度≥99.5%) 美國(guó)Sigma公司;抗閉合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、TLR4、CD14、β-actin抗體 美國(guó)Santa Cruz公司;聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜 美國(guó)Millipore公司;BD Difco脫脂奶粉skim milk 上海力敏實(shí)業(yè)有限公司;IgG辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒 北京碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL顯色試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司;微生物培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

Eppendorf Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;AdventurerTM通用型分析天平 美國(guó)OHAUS公司;Biorad550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)BioTek公司;尼康E100生物顯微鏡 日本尼康公司;IKAMS2型振蕩器 德國(guó) IKA公司;TYZD-II型水平搖床 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Bio-rad垂直平板電泳槽 美國(guó) Bio-Rad公司;DYCZ-30B垂直電泳儀 北京六一儀器廠;WDD-1發(fā)光測(cè)試儀 北京第二光學(xué)儀器廠;BCD-260WDGQ型低溫冰箱 海爾集團(tuán);MDF-C8V1超低溫冰箱 日本三洋公司;HH-2電熱恒溫水浴箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,9周齡,300～350 g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2011-0012)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng),每籠3只,自由飲食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級(jí),溫度范圍(22±1) ℃,相對(duì)濕度40%～50%,室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠50只,適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal control group)、酒精模型組(Alcohol control group)、等熱量對(duì)照組(Dextrose control group)、0.04%和0.16%核苷酸(NTs)干預(yù)組,每組10只,除正常對(duì)照組和等熱量對(duì)照組外,其余30只大鼠使用50%酒精(v/v)灌胃,為提高大鼠對(duì)酒精的適應(yīng)性,酒精初始灌胃量為每天2 g/kg·bw,隨后每天增加0.5 g/kg·bw,2周后灌胃劑量達(dá)到并穩(wěn)定在8 g/kg·bw,此為維持劑量,之后每天灌胃2次(灌胃時(shí)間為8:00 a.m.和3:00 p.m.),每次灌胃酒精4 g/kg·bw,繼續(xù)干預(yù)4周,干預(yù)第6周末用代謝籠準(zhǔn)確量取各組大鼠進(jìn)食量。正常對(duì)照組每天灌胃等體積的蒸餾水,等熱量對(duì)照組每天灌胃與酒精模型組熱量相等的右旋糖溶液(0.875 g/mL)。正常對(duì)照組、酒精模型組和等熱量對(duì)照組大鼠給予AIN-93G飼料喂養(yǎng),0.04%和0.16%核苷酸干預(yù)組是在AIN-93G飼料基礎(chǔ)上每千克分別添加0.4 g和1.6 g核苷酸所制成。

1.4 結(jié)腸組織切片形態(tài)學(xué)觀察

大鼠處死后,迅速分離橫結(jié)腸中段1～2 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)制作石蠟切片,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

取0.1 g結(jié)腸組織,加入冰預(yù)冷的RIPA裂解液,置于冰上并用玻璃勻漿器充分勻漿至完全裂解,4 ℃,12000 r/min,離心5 min后吸取上清液。采用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后,分別將抗閉合蛋白(Claudin)(1∶200)、咬合蛋白(Occludin)(1∶200)、Toll樣受體4(TLR4)(1∶200)、分化抗原簇14(CD14)(1∶200)和β-actin(1∶1000)抗體用5%牛血清白蛋白稀釋,4℃孵育過夜。洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶4000)于37 ℃恒溫箱中孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行成像,WDD-1發(fā)光測(cè)試儀檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參,利用Image Pro-plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Inc.)進(jìn)行灰度分析[11]。

1.6 腸道菌群培養(yǎng)

按照培養(yǎng)基說明配制所需培養(yǎng)基,處死大鼠后,迅速取大鼠結(jié)腸內(nèi)容物0.1 g,加入10 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分振蕩混勻,再稀釋到所需濃度。雙歧桿菌采用10-4、10-5和10-6三個(gè)稀釋度,滴種2 μL標(biāo)本液于培養(yǎng)基上;乳酸桿菌采用10-3、10-4和10-5三個(gè)稀釋度,點(diǎn)樣體積2 μL;大腸桿菌、腸球菌均采用10-4和10-5兩個(gè)濃度,點(diǎn)樣體積5 μL。

表1 各組大鼠24 h進(jìn)食量Table 1 The food intake of rats for 24 h

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化(400×)Fig.1 The pathological structure change in colon of rats(400×)注:A:正常對(duì)照組;B:酒精模型組;C:等熱量對(duì)照組;D:0.04%核苷酸組;E:0.16%核苷酸組;圖2、圖4同。

雙歧桿菌、乳酸桿菌置于37 ℃恒溫厭氧罐內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h,大腸桿菌及腸球菌置于37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,觀察并記錄每克結(jié)腸內(nèi)容物的菌落數(shù)量,結(jié)果表示為lg CFU/g。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠24 h進(jìn)食量

如表1所示,各組大鼠24 h進(jìn)食量沒有顯著性差異(p>0.05)。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化

如圖1(A和C)所示,正常對(duì)照組和等熱量對(duì)照組大鼠腸道結(jié)構(gòu)完整,粘膜層、固有層、粘膜下層和肌層清晰可見,粘膜層和固有層杯狀細(xì)胞豐富、腸腺發(fā)達(dá)、排列規(guī)則;酒精模型組大鼠結(jié)腸粘膜不完整,杯狀細(xì)胞減少,可見潘氏細(xì)胞,粘膜下層可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肌層不完整(圖1B);與酒精模型組相比,核苷酸干預(yù)組大鼠結(jié)腸粘膜較為完整,炎性細(xì)胞減少,肌層較完整(見圖1D和E),表明核苷酸可有效改善酒精引起的大鼠結(jié)腸組織病理性結(jié)構(gòu)變化。

2.3 各組大鼠結(jié)腸功能相關(guān)蛋白Claudin和Occludin的表達(dá)變化

Claudin和Occludin是細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)過程中構(gòu)成緊密連接的主要跨膜蛋白,在腸道屏障功能發(fā)揮中扮演著重要角色。如圖2及圖3所示,與等熱量對(duì)照組相比,酒精模型組大鼠結(jié)腸組織中Claudin和Occludin的表達(dá)均顯著降低(p<0.01),說明酒精能夠破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接,影響其結(jié)構(gòu)和功能,在一定程度上增加了結(jié)腸通透性;與酒精模型組相比,5′-核苷酸干預(yù)能夠顯著上調(diào)結(jié)腸組織中Occludin和Claudin的蛋白表達(dá)水平(p<0.01或p<0.05),且呈劑量依賴關(guān)系,表明核苷酸干預(yù)可以有效提高大鼠結(jié)腸組織中Claudin和Occludin的表達(dá)水平,從而改善酒精引起的結(jié)腸結(jié)構(gòu)和功能損傷。

圖2 各組大鼠結(jié)腸功能相關(guān)蛋白電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of colon function related protein in rats

圖3 各組大鼠結(jié)腸功能相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Fig.3 The expression of colon function related protein in rats.注:與等熱量對(duì)照組相比,*p<0.05,**p<0.01; 與酒精模型組相比,#p<0.05,##p<0.01;圖5、表1同。

表2 各組大鼠回腸內(nèi)容物雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及大腸桿菌變化Table 2 Changes of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,E. coli in ileum contents of rats(±s,n=10)

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14的表達(dá)變化

如圖4及圖5所示,與等熱量對(duì)照組相比,酒精模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14蛋白表達(dá)水平顯著增高(p<0.01);而與酒精模型組相比,膳食中添加0.04%和0.16%核苷酸組能夠極顯著抑制酒精引起的大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14蛋白表達(dá)水平的升高(p<0.01)。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14蛋白電泳圖Fig.4 The electrophoretogram of TLR4 and CD14 in colon of rats

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14的表達(dá)變化Fig.5 The protein expression levels of TLR4 and CD14 in colon of rats

TLR4和CD14為L(zhǎng)PS/LPS結(jié)合蛋白(LPS-binding protein,LBP)復(fù)合物受體,可介導(dǎo)LPS引起的炎癥反應(yīng)[12]。Hritz等[13]研究發(fā)現(xiàn),酒精攝入會(huì)導(dǎo)致野生型小鼠TLR4、CD14及炎癥因子水平明顯升高。人群研究也發(fā)現(xiàn)酗酒者體內(nèi)內(nèi)毒素和CD14水平明顯高于健康者[14]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,酒精模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14的表達(dá)水平顯著增高(p<0.01),推測(cè)其原因可能是酒精引起的腸道菌群紊亂導(dǎo)致有害菌大量增長(zhǎng),通過結(jié)腸上皮進(jìn)入血液,出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。而外源性5′-核苷酸能夠極顯著降低大鼠結(jié)腸組織中TLR4和CD14的表達(dá)水平(p<0.01),說明核苷酸能夠促進(jìn)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改善,進(jìn)而緩解內(nèi)毒素血癥所致的結(jié)腸結(jié)構(gòu)和功能障礙,這可能是核苷酸發(fā)揮結(jié)腸保護(hù)作用的機(jī)制之一。

2.5 各組大鼠回腸內(nèi)容物中腸道菌群變化

如表2所示,與等熱量對(duì)照組相比,酒精模型組大鼠回腸內(nèi)容物中雙歧桿菌減和乳酸桿菌均顯著減少(p<0.05),而腸球菌及大腸桿菌數(shù)量顯著增多(p<0.05)。與酒精模型組相比,0.04%和0.16%核苷酸組大鼠回腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著增多(p<0.05);同時(shí)0.04%和0.16%核苷酸組大鼠回腸內(nèi)容物中腸球菌及大腸桿菌數(shù)量較酒精模型組顯著減少(p<0.05)。

研究證實(shí),腸道菌群與宿主的各種生理功能息息相關(guān),直接參與機(jī)體的消化、吸收、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)[15-17]。腸道菌群紊亂也會(huì)引胃腸道疾病(結(jié)腸癌、非炎癥性腸病)及慢性非傳染性疾病(肥胖、糖尿病等)等疾病的發(fā)生[18-19]。在腸道菌群中,擬桿菌門和厚壁菌門占主要地位,二者大約占微生物總量的90%,正常情況下,這些腸道微生物處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[20]。然而,過量攝入酒精可導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生失衡,乳桿菌、雙歧桿菌、多形桿狀菌等主要產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬數(shù)量大幅下降,使得短鏈脂肪酸產(chǎn)生減少,造成腸粘膜營(yíng)養(yǎng)不足,還可減少與腸上皮細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)的GLP-2表達(dá),進(jìn)而會(huì)抑制腸上皮緊密連接蛋白-1(ZO-1)和Occludin蛋白的表達(dá),使腸道的屏障功能受損,腸道的通透性增加,促進(jìn)大量脂多糖(LPS)由腸道入血;另一方面,酒精可促進(jìn)腸球菌和大腸桿菌等的繁殖,LPS大量增加,導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥,引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酒精模型組大鼠回腸內(nèi)容物中有益菌群雙歧桿菌和乳酸桿菌較等熱量對(duì)照組顯著降低(p<0.05),而腸球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌顯著增多(p<0.05),表明酒精可引起大鼠回腸內(nèi)腸道菌群紊亂;核苷酸干預(yù)能夠改善酒精引發(fā)的大鼠腸道菌群紊亂,這與早期報(bào)道相一致[22]。

3 結(jié)論

采用50%乙醇灌胃,成功誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸功能損傷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明膳食添加核苷酸能夠有效減輕酒精引起的結(jié)腸結(jié)構(gòu)損傷,顯著提高結(jié)腸功能相關(guān)蛋白Claudin和Occludin的表達(dá),其作用機(jī)制可能與核苷酸能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群,顯著降低LPS介導(dǎo)受體TLR4和CD14的表達(dá)水平有關(guān)。本研究為5′-核苷酸應(yīng)用于酒精性結(jié)腸損傷的臨床營(yíng)養(yǎng)治療提供了實(shí)踐證明和理論依據(jù)。但其保護(hù)作用的具體調(diào)節(jié)通路及最佳攝入量仍有待進(jìn)一步探究。

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Effects of 5′-nucleotides on the injury of colon function induced by chronic alcoholism in rats

BAO Lei1,XIAO Yang1,CAI Xia-xia2,WANG Nan2,LI Yong2

(1.Department of Nutrition and Dietetics,Peking University International Hospital,Beijing 102206,China; 2.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Peking University,Beijing 100191,China)

The aim of this study was to investigate the protective effects of exogenous 5′-nucleotides on alcohol induced colon function injury in SD rats. Fifty SPF male Wistar rats were randomly divided into normal control group,alcohol model group,dextrose control group,0.04% and 0.16% nucleotides intervention group. After continuous ethanol lavage for 6 weeks,the results showed that exogenous 5′-nucleotides could effectively improve the pathological changes of colon in rats induced by alcohol,increase the expression levels of Claudin and Occludin and reduce the levels of TLR4 and CD14 in colon tissues(p<0.01). The numbers ofBifidobacterium(8.32 vs. 8.00 log CFU/g)andLactobacillus(8.13 vs. 7.44 log CFU/g)in ileum contents were significantly decreased,and the numbers ofEnterococcus(7.03 vs. 7.52 log CFU/g)andE.coli(6.19 vs. 6.85 log CFU/g)were significantly decreased in nucleotides intervention groups when compared with the alcohol model group(p<0.05). Therefore,exogenous 5′-nucleotides could improve the alcohol induced colon function injury in rats which may attribute to the regulation of gut microbiota.

5′-nucleotides;colon function;gut microbiota

2016-11-28

鮑雷(1984-),男,博士,主管技師,研究方向:營(yíng)養(yǎng)與疾病,E-mail:baolei6230@163.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.059