李 雪,皮鈺珍,*,尚菲菲,錢 坤(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 0866)

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響應(yīng)面法優(yōu)化超濾提純梅花鹿角盤多肽工藝

李 雪1,皮鈺珍1,*,尚菲菲2,錢 坤2
(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

采用超濾法分離梅花鹿角盤多肽溶液,考察了超濾操作壓力、操作時間和料液質(zhì)量分數(shù)對膜滲透通量的影響,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法對影響梅花鹿角盤多肽超濾效果的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化探討,確定最佳分離工藝條件:料液質(zhì)量分數(shù)1.44%、操作壓力0.13 MPa、操作時間60 min。在此條件下,膜滲透通量為1.72 L/m2·h,分離后的樣品中多肽含量為45.2%,達到了較好的提純效果。

梅花鹿角盤多肽,超濾,響應(yīng)面

梅花鹿角盤是雄性梅花鹿或馬鹿經(jīng)鋸茸后,于次年脫落的盤狀骨化殘角,是介于鹿茸骨化和未骨化之間十分堅硬的盤狀物質(zhì)[1-2]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載:“梅花鹿角盤具有溫補肝腎、活血消腫、治陰癥瘡瘍、乳癰初起、瘀血腫痛等功效”,民間用“梅花鹿角盤”治療乳腺增生效果尤為顯著[3-5]。

梅花鹿角盤的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和核酸等,且多數(shù)研究認為梅花鹿角盤的藥效與其中的生物活性肽密切相關(guān)[6]。王志兵等[7]采用超微粉碎、浸提、鹽析、酶解、透析等方法獲得的鹿角脫盤蛋白多肽對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能有顯著影響。黃鳳杰等[8]以鹿角脫盤為原材料,經(jīng)稀醋酸提取后利用Resource S、Superdex 75、反相HPLC進一步純化得到的多肽具有明顯的降糖活性。采用雙酶水解法制備的生物活性肽,分子量范圍較大且含有大量雜質(zhì),需對其進一步分離、純化以獲取純度與活性較高的多肽。而超濾法是目前使用較普遍的肽類分離方法[9-14]。本實驗利用超濾技術(shù)對梅花鹿角盤多肽進行初步分離,研究操作條件對分離效果的影響,利用響應(yīng)面法確定最佳工藝條件,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿角盤粉 由遼寧西豐養(yǎng)鹿場提供(80目);胰蛋白酶(2.5×105U/g)、木瓜蛋白酶(4.0×105U/g) 均為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;乙醇 分析純。

7200型可見分光光度計 尤尼柯(上海)有限公司;SCM杯式超濾系統(tǒng) 上海斯納普膜分離科技有限公司;磁力攪拌器 天津市歐譜儀器儀表有限公司;超濾膜 截留相對分子質(zhì)量10 kD;BCA蛋白定量試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅花鹿角盤多肽的提取工藝 梅花鹿角盤粉→磁力攪拌器混勻處理→pH8.0、溫度49 ℃、以加酶量11000 U/g、酶活比(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶)2∶1，水解270 min→滅酶(95 ℃水浴10 min)→離心(4500 r/min,15 min)→收集上清液→對沉淀物離心2次→合并上清液→梅花鹿角盤多肽酶解液[15]。

梅花鹿角盤多肽酶解液的超濾流程：在安裝好的超濾杯中加入梅花鹿角盤多肽酶解液,將超濾杯放在磁力攪拌器上,打開磁力攪拌器使攪拌子以合適的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動,通入氮氣調(diào)整壓力,收集濾出液。

1.2.2 單因素實驗 采用超濾技術(shù)對梅花鹿角盤中的活性多肽進行分離,以膜滲透通量為考察指標,考察料液質(zhì)量分數(shù)、操作壓力、操作時間對分離效果的影響。

1.2.2.1 料液質(zhì)量分數(shù)對滲透通量的影響 在操作壓力0.12 MPa,操作時間40 min的條件下,分別考察不同料液質(zhì)量分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對滲透通量的影響。

1.2.2.2 操作壓力對滲透通量的影響 在料液質(zhì)量分數(shù)1.0%,操作時間40 min的條件下,分別考察不同操作壓力(0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 MPa)對滲透通量的影響。

1.2.2.3 操作時間對滲透通量的影響 在料液質(zhì)量分數(shù)1.0%,操作壓力0.12 MPa的條件下,分別考察不同操作時間(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min)對滲透通量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以操作壓力、操作時間、料液質(zhì)量分數(shù)為考察因素,以滲透通量為考察指標,進行中心組合設(shè)計實驗,因素水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

式中:Jv為滲透通量，L/m2·h；V為超濾流出體積,L;S為有效膜面積,0.005 m2;t為超濾所用時間,h。

1.2.5 蛋白含量測定 采用BCA蛋白定量試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液質(zhì)量分數(shù)對滲透通量的影響 蛋白質(zhì)和多肽都是兩性化合物,表面活性較強,極易在聚合物表面聚集,使超濾膜表面形成濃差極化和凝膠層[16-17]。在超濾的初始階段,滲透通量下降較緩慢,但隨著超濾的進行,大分子溶質(zhì)被膜截留,并在膜表面聚集,當膜表面溶質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)大于溶液主體質(zhì)量分數(shù)時,溶質(zhì)與水反向向溶液主體擴散,形成濃差極化現(xiàn)象,滲透通量急劇下降。由圖1可知,隨著料液質(zhì)量分數(shù)的增加滲透通量逐漸下降,當料液質(zhì)量分數(shù)大于1.5%時,濃差極化現(xiàn)象嚴重,滲透通量下降迅速。綜合考慮,最終確定料液質(zhì)量分數(shù)為1.5%。

圖1 料液質(zhì)量分數(shù)對滲透通量的影響Fig.1 Effect of materical-liquid ratio on infiltration flux

2.1.2 操作壓力對滲透通量的影響 超濾是以膜兩側(cè)的壓力差為過程推動力的膜分離過程,當壓力增大時,超濾膜的膜透過率也增大。由圖2可知,在0.04～0.12 MPa的范圍內(nèi),隨壓力的增加,滲透通量明顯增大,這是由于物料沒有形成明顯的濃差極化層,膜本身的阻力占主導(dǎo)作用,所以通量隨壓力的增加,增加得較快;在0.12～0.14 MPa范圍內(nèi),滲透通量增加的幅度減小,這可能是壓力過大使大分子蛋白聚集,加劇了濃差極化現(xiàn)象造成的。由此可知操作壓力為0.12 MPa時較為合適。

圖2 操作壓力對滲透通量的影響Fig.2 Effect of operation pressure on infiltration flux

2.1.3 操作時間對滲透通量的影響 由圖3可知,隨著操作時間的延長,滲透通量逐漸下降,這是因為隨著超濾的進行,蛋白質(zhì)和一些大分子物質(zhì)被膜截留,使得膜表面逐漸形成凝膠層,滲透通量逐漸下降。如圖3在超濾進行的初始階段10～40 min范圍內(nèi),流速較大,湍流現(xiàn)象可以阻止凝膠層的形成,此時滲透通量下降較緩慢;當操作時間超過100 min后,蛋白質(zhì)和一些大分子物質(zhì)在膜表面聚集形成凝膠層,濃差極化現(xiàn)象嚴重,滲透通量下降迅速。因此,超濾操作時間不應(yīng)超過100 min,否則影響膜通透性。

圖3 操作時間對滲透通量的影響Fig.3 Effect of operation time on infiltration flux

2.2 超濾工藝的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以滲透通量為考察指標,以料液質(zhì)量分數(shù)、操作壓力、操作時間為考察因素,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的實驗方案及實驗結(jié)果見表2。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

注:*顯著(p<0.05);**極顯著(p<0.01)。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行回歸分析,回歸分析結(jié)果見表3,對各因素回歸擬合后,得到回歸方程為:Y=1.71+0.13A+0.068B-0.036C+0.030AB-0.015AC-0.019BC-0.21A2-0.016B2-0.16C2

由圖4可較直觀地看出各因素交互作用對膜滲透通量的影響,若曲線越陡峭,則表明該因素對膜滲透通量的影響越大,相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小[21-23]。由等高線可看出存在極值的條件應(yīng)在圓心處,從圖4可以看出操作壓力對膜滲透通量的影響最大,操作時間次之,表3回歸分析也與之吻合。

圖4 兩因素的交互作用對膜滲透通量的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of variable parameters on infiltration flux

通過Desigh-Expert 8.0.6 軟件分析可知,梅花鹿角盤多肽超濾工藝的最佳條件為:料液質(zhì)量分數(shù)1.44 %、操作壓力0.13 MPa、操作時間60 min,在此優(yōu)化條件下,梅花鹿角盤多肽超濾工藝的模型理論值為1.80 L/m2·h,通過驗證實驗?zāi)B透通量可達到1.72 L/m2·h,與理論預(yù)測值的相對誤差在4.4%左右,因此響應(yīng)面法所得的超濾條件參數(shù)準確可靠,具有實用價值。

2.3 梅花鹿角盤多肽含量測定

采用BCA蛋白定量試劑盒常規(guī)模式,檢測出分離后樣品中多肽含量為45.2%。

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面實驗設(shè)計對梅花鹿角盤多肽超濾分離工藝進行優(yōu)化,確定優(yōu)化條件為:料液質(zhì)量分數(shù)1.44%、操作壓力0.13 MPa、操作時間60 min。在此條件下,膜滲透通量為1.72 L/m2·h,分離后的樣品中多肽含量為45.2%。

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Response surface methodology for optimization of ultrafiltration condition for purification of sika deer antler base peptide

LI Xue1,PI Yu-zhen1,*,SHANG Fei-fei2,QIAN Kun2

(College of Food,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,China)

The peptide was separated through ultrafiltration from sika deer antler base. The major factors such as pressure,operation time,and material-liquid ratio were investigated to evaluate the effect on infiltration flux. Based on one-factor-at-a-time method,Box-Behnken response surface methodology(RSM)was taken to optimize the key factors that affect the effect of the sika deer antler peptide ultrafiltration. The optimal separation condition was 1.44% of material-liquid ratio,0.13 MPa of pressure,and 60 min of operation time. Under this condition,the infiltration flux could be reached 1.72 L/m2·h,peptide content in separated samples was 45.2%,better purification effect was achieved.

sika deer antler base peptide;ultrafiltration;response surface methodology

2017-01-03

李雪(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：動物性食品加工，E-mail：1045830497@qq.com。

*通訊作者:皮鈺珍(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：動物性食品加工，E-mail：Yuzhen_pi@sina.com。

遼寧省優(yōu)秀人才培育項目(2015020771)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)14-0223-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.043