閆慧嬌,王志偉,王岱杰,安春燕,耿巖玲,王 曉,*(.山東省中藥質量控制重點實驗室,山東省分析測試中心,山東濟南 5004; .山東理工大學生命科學學院,山東省生物信息工程技術中心,山東淄博 55000)

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牡丹花中三種活性成分的快速分離方法

閆慧嬌1,王志偉1,王岱杰1,安春燕2,耿巖玲1,王 曉1,*
(1.山東省中藥質量控制重點實驗室,山東省分析測試中心,山東濟南 250014; 2.山東理工大學生命科學學院,山東省生物信息工程技術中心,山東淄博 255000)

建立應用高速逆流色譜快速分離牡丹花中黃酮及酚酸類活性成分方法。實驗采用70%乙醇浸提牡丹花瓣,浸提物減壓濃縮后經(jīng)D101大孔樹脂乙醇洗脫富集后,采用乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4兩相系統(tǒng)進行高速逆流色譜分離,化合物結構通過1H NMR、13C NMR、MS確定。從牡丹花中一次性分離出三種化學成分,分別為野漆樹苷(Ⅰ)、沒食子酸(Ⅱ)、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷(Ⅲ),化合物純度經(jīng)高效液相色譜檢測均達到95%以上。實驗建立的方法是快速分離富集純化牡丹花中三種黃酮、酚酸類活性成分的有效方法。

牡丹花,黃酮，酚酸，分離,高速逆流色譜

圖1 化合物的結構式Fig.1 Chemical structures of the compounds

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是芍藥屬植物,為多年生落葉灌木。我國傳統(tǒng)名貴觀賞植物,其中以洛陽、菏澤牡丹最富盛名[1]。牡丹花在我國有悠久的藥用和食用歷史,《四川中藥志》載:牡丹花性平、苦、淡,具有調經(jīng)活血的功能[2]。而明《遵生八菚》上曾記有“牡丹新落花瓣亦可煎食”,清《養(yǎng)小錄》記載:“牡丹花瓣,湯淖可,蜜浸可。肉汁燴亦可”。牡丹花中活性成分種類多,含量豐富。研究表明牡丹花瓣中含有豐富的黃酮多酚類物質[3-4]、維生素(維生素B1、維生素B2和類胡蘿卜素等)和礦物質(Ca、K、P、Mg、Se等)、蛋白質和氨基酸種類齊全[5-6],富含不飽和脂肪酸,是一種較好的天然營養(yǎng)保健資源。丹鳳牡丹花更是2015年列入新資源食品名錄。在崇尚回歸自然的理念下,牡丹花作為普通綠色食品或保健食品前景都十分廣闊。野漆樹苷、沒食子酸、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷是牡丹花中主要化學成分,也是公認具有廣泛生物活性的化合物,對牡丹花產(chǎn)品的質量控制和精深加工具有重要意義。

高速逆流色譜(High-Speed Counter-Current Chromatography,HSCCC),是一種連續(xù)特殊的流體動力學平衡基礎上的液-液分配色譜技術,不使用固態(tài)色譜填料,制備成本相對較低且容易實現(xiàn)較大的制備量。與傳統(tǒng)的分離純化方法相比具有樣品前處理簡單、重復性好、避免填料對樣品的吸附等特點[7-8],在黃酮、酚酸、生物堿等類型化合物的分離中優(yōu)點明顯。耿巖玲等采用超臨界CO2萃取丹皮后高速逆流色譜分離純化得到純度大于99%的丹皮酚[9],羅婭君等采用高速逆流色譜利用氯仿-甲醇-水體系分離與鑒定了5個牡荊化學成分[10],徐雙雙等采用硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離得到荷花中3個黃酮類化合物[11]。牡丹花中活性成分復雜且含量較低,直接采用HSCCC分離純化所得化合物的產(chǎn)量和純度低,而傳統(tǒng)的柱色譜法耗時長、分離損失大。王曉等采用聚酰胺對牡丹花中的黃酮類成分富集分段后,采用高速逆流色譜分離得到4個黃酮單體化合物[12]。為了對牡丹花的成分有進一步的分析和利用,選擇了對化合物類型適用范圍更廣的大孔樹脂柱色譜進行前處理,結合高速逆流色譜,可以一次性得到酚酸和黃酮(野漆樹苷、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷和沒食子酸,圖1)兩種類型牡丹花主要活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹花 采自山東菏澤,牡丹花瓣60 ℃鼓風干燥至恒重;D101大孔樹脂 滄州寶恩化工有限公司;乙醇(分析純) 德州恒業(yè)化工有限公司;石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析純) 天津市化學試劑廠;甲醇、乙腈(色譜純) 山東禹王試劑有限公司;甲酸(色譜純) 德國Riedel 公司。

KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BUCH旋轉蒸發(fā)儀 瑞士BUCH公司;同田HSCCC儀器系統(tǒng) 中國上海同田生化技術有限公司;AUW220D型電子分析天平 日本Shimadzu公司;Agilent 1120型高效液相色譜儀(配有DAD檢測器,自動進樣器) 美國Agilent 公司;Varian-400型核磁共振儀 美國Varian公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹花提取物的制備及預處理 干燥牡丹花瓣于70%乙醇60 ℃溫浸兩次(料液比8∶1 mL·g-1),每次4 h,減壓濃縮,粗浸膏經(jīng)D101大孔樹脂精制(上樣量10∶1),依次以純水、10%、60%、90%乙醇梯度洗脫(每個洗脫劑用量為3倍柱體積),收集10%和60%部分,減壓濃縮干燥,得牡丹花提取物。

1.2.2 高效逆流色譜溶劑體系的選擇 用HPLC測定樣品中目標成分在不同溶劑體系中的分配系數(shù)(KD),KD值的測定過程如下:取適量樣品置于10 mL試管中,加入預先分配平衡的兩相溶劑系統(tǒng)的上相和下相各2 mL劇烈振蕩使其充分溶解和混合,靜置分層后,取等體積的上相和下相,分別通過HPLC進行檢測,KD值按下式計算:KD=A1/A2(A1目標化合物在上相中的峰面積;A2目標化合物在下相中的峰面積)。

1.2.3 HSCCC溶劑體系及樣品溶液的制備 取乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、水四種溶液按5∶1∶0.5∶4的比例配制成2 L溶液,在分液漏斗充分振蕩靜置分層。將上相和下相分別放在兩個容器中,超聲脫氣備用。

取牡丹花提取物100 mg,溶于乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4溶劑體系上下相各10 mL。

1.2.4 HSCCC分離過程 將固定相(上相)注入螺旋管,流速是20 mL/min,流動相(下相)注入螺旋管流速是2 mL/min,注入流動相時調節(jié)主機順時針旋轉,轉速為850 r/min左右。待螺旋管中的上相和下相達到流體動力學平衡后。打開紫外檢測器,調節(jié)吸收波長是254 nm。同時將20 mL樣品全部注入高速逆流色譜儀。根據(jù)紫外吸收色譜圖手動收集各色譜峰組分。

1.2.5 高效液相色譜檢測 將手動收集組分進行高效液相檢測。合并高純度組分，蒸干，得組分Ⅰ～Ⅲ。并對組分Ⅰ～Ⅲ進行純度檢測。檢測條件：Agilent 1120 型高效液相色譜儀,色譜柱:YMC ODS C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫:25 ℃。流動相A:甲醇;流動相B:0.1%(v/v)甲酸水溶液;線性梯度洗脫程序:0～20 min,25% A～100% A;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:254 nm。

1.2.6 化合物的鑒定 HSCCC 分離得到的各化合物結構經(jīng)過電噴霧離子質譜(ESI-MS)、核磁共振氫譜(1H-NMR)和核磁共振碳譜(13C-NMR)鑒定。質譜分析條件:正離子模式,樣品通過流動注射泵進樣,體積流量0.2 mL/min,干燥氣溫度350 ℃;干燥器流量9.0 L/min;霧化氣壓強24.1 Pa;毛細管電壓4 kV;質量掃描范圍m/z 50～1200,實驗前質量數(shù)經(jīng)過校正。核磁共振過程中溶劑為二甲基亞砜(DMSO),四甲基硅烷(TMS)作為內標物質。

表1 目標化合物在不同的溶劑體系中的分配系數(shù)(KD)Table 1 Partition coefficients(KD)of the 3 compounds in several solvent systems

2 結果與分析

2.1 HSCCC溶劑體系的選擇與優(yōu)化

圖3 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms 注:a:牡丹花提取物,b:野漆樹苷(Ⅰ),c:沒食子酸(Ⅱ)，d:芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷(Ⅲ)。

在高速逆流色譜中,所選溶劑體系為互不相溶的兩相液體且上下相體積比約為1,分層時間小于30 s。溶劑體系合適與否由目標化合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)(KD)來衡量,HSCCC最適合的KD值范圍為0.5～2.0[7]。本實驗中,對比正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水體系、乙酸乙酯∶甲醇∶水體系、乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水體系,測定了目標化合物在不同溶劑體系中的KD值。如表1可以看出,乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶1.5∶4和乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4溶劑系統(tǒng)較為接近理想KD值,但從實際的分離效果來看,采用乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4兩相溶劑體系時,分離效果較好。

2.2 HSCCC分離

采用乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4體系,按照1.2.4節(jié)所述實驗方法對1.2.3節(jié)制備的樣品進行HSCCC分離,固定相保留值為26.1%。根據(jù)HSCCC 譜圖手動分段收集,分離結果見圖2。通過HPLC檢測,陰影部分為純度較高的餾分,分別將其合并為組分Ⅰ～Ⅲ,減壓濃縮干燥后稱其質量分別為6.9、8.1、17.2 mg。

圖2 HSCCC制備分離牡丹花提取物分離色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of the crude extract from Paeonia suffruticosa Andr.注:Ⅰ野漆樹苷,Ⅱ沒食子酸, Ⅲ芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷。

2.3 HPLC純度測定

采用1.2.5項下方法,檢測結果如圖3所示。圖3顯示牡丹花粗提物以及分離得到三個化合物的高效液相色譜圖和相應紫外吸收譜圖。采用峰面積歸一化法,測定野漆樹苷(Ⅰ),沒食子酸(Ⅱ)和芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷(Ⅲ)純度分別為95.4%、97.0%、96.3%。

2.4 結構解析

化合物Ⅰ:淡黃色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z:579[M+H]+.1H NMR(DMSO,400 MHz):δH12.94(1H,s,OH),7.96(2H,d,J=7.6 Hz,H-2′,6′),6.97(2H,d,J=7.6 Hz,H-3′,5′),6.91(1H,s,H-3),6.82(1H,s,H-8),6.39(1H,s,H-6),5.26(1H,d,J=6.0 Hz,H-1″),5.16(1H,brs,H-1?),3.21-3.75(9H,m,H-2″-6″,H-2?-5?),1.22(3H,s,H-6?);13C NMR(DMSO,100 MHz):δC182.5(C-4),164.8(C-2),163.1(C-7),162.1(C-4′),161.6(C-5),157.5(C-9),129.1(C-2′,6′),121.4(C-1′),116.6(C-3′,5′),105.9(C-10),103.7(C-3),100.9(C-1″),99.9(C-6),98.5(C-1?),95.1(C-8),77.8(C-2″),77.7(C-3″),76.8(C-5″),72.3(C-4?),71.1(C-3?),71.0(C-2?),70.2(C-4″),68.9(C-5?),61.1(C-6″),18.7(C-6?)。1H NMR 給出δH6.91(1H,s),6.82(1H,s)和6.39(1H,s)為黃酮A環(huán)上3位,8位,6位上的氫信號。δH7.96(2H,d,J=7.6 Hz,H-2′,6′)和 6.97(2H,d,J=7.6 Hz,H-3′,5′)為黃酮B環(huán)氫信號。δH1.22(3H,s)為鼠李糖上甲基氫信號。13C NMR給出δC100.9、98.5為兩個糖的端基碳信號,δC18.7處為鼠李糖甲基碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道對照基本一致,故鑒定化合物為野漆樹苷。

化合物Ⅱ:白色粉末(甲醇),ESI-MS m/z:171[M+H]+.1H NMR(DMSO,400 MHz):δH9.33(3H,brs,OH),6.94(2H,s,H-2,6);13C NMR(DMSO,100 MHz):δC168.2(C-7),145.9(C-3,5),138.5(C-4),121.3(C-1),109.3(C-2,6)。1H NMR給出δH6.94(2H,s)為苯環(huán)上對稱的鄰位氫信號。13C NMR給出6個苯環(huán)C信號和一個羧酸羰基δC168.2信號。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道對照基本一致,故鑒定化合物為沒食子酸。

化合物Ⅲ:淡黃色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z:433[M+H]+.1H NMR(DMSO,400 MHz):δH12.99(1H,s,OH),10.43(1H,s,OH),7.98(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.96(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),6.90(1H,s,H-3),6.85(1H,s,H-8),6.46(1H,s,H-6),5.09(1H,d,J=6.8 Hz,H-1″),4.64(1H,brs,OH),3.11-3.90(6H,m,H-2″-6″);13C NMR(DMSO,100 MHz):δC182.6(C-4),164.8(C-7),163.5(C-2),161.9(C-5),161.7(C-9),157.5(C-4′),129.3(C-2′,6′),121.7(C-1′),116.7(C-3′,5′),106.1(C-3),103.8(C-10),100.6(C-1″),100.2(C-6),95.5(C-8),77.9(C-5″′),77.1(C-3″),73.8(C-2″),70.2(C-4″),61.3(C-6″)。1H NMR給出δH6.90(1H,s),6.85(1H,s),6.46(1H,s)為黃酮A環(huán)上3位,8位,6位上的氫信號。δH7.98(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.96(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′)為黃酮B環(huán)氫信號。13C NMR給出δC100.4為葡萄糖的端基碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道對照基本一致,故鑒定化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

3 結論

牡丹花富含黃酮及多酚類化合物,化學成分復雜,采用傳統(tǒng)的柱色譜分離純化耗時長,得率低。本實驗采用70%乙醇浸提牡丹花瓣,浸提物減壓濃縮后經(jīng)大孔樹脂富集,富集得到了牡丹花中的活性組分,減少雜質對后續(xù)分離的干擾。然后采用高速逆流色譜乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=5∶1∶0.5∶4兩相系統(tǒng)分離,化合物結構通過1H NMR、13C NMR、MS確定。從牡丹花中一次性分離出野漆樹苷、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷、沒食子酸,化合物純度經(jīng)高效液相色譜檢測均達到95%以上。該方法工作量小、快速、重復性好,且能同時得到黃酮和酚酸兩類活性物質,具有較好的實用價值,為進一步開發(fā)利用牡丹花資源提供了一定的參考。

[1]趙蘭勇. 中國牡丹栽培與鑒賞[M]. 北京:金盾出版社,2004:200-280.

[2]江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典上冊[M]. 上海:上?？茖W技術出版社,1985:1130.

[3]閆慧嬌,趙偉,耿巖玲,等. 牡丹花化學成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(12):2056-2059.

[4]趙偉,耿巖玲,崔莉,等. 牡丹花黃酮類化學成分研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥,2016,18(3):303-306.

[5]史國安,郭香鳳,包滿珠. 不同類型牡丹花的營養(yǎng)成分及體外抗氧化活性分析[J]. 農業(yè)機械學報,2006,37(8):111-114.

[6]徐小博,賈文慶,劉會超. 牡丹品種間花瓣營養(yǎng)成分差異[J]. 浙江農林大學學報,2012,29(5):729-733.

[7]張?zhí)煊?王曉. 高速逆流色譜[M].北京:化學工業(yè)出版社,2011:1-58.

[8]曹雪麗. 高速逆流色譜分離技術及應用[M]. 北京:化學工業(yè)出版社,2005:188-189.

[9]耿巖玲,劉建華,王岱杰,等.超臨界CO2萃取-高速逆流色譜分離純化丹皮中丹皮酚[J]. 山東科學,2009,22(6):13-16.

[10]羅婭君,邊清泉,張琦,等. 高速逆流色譜分離與鑒定牡荊化學成分[J]. 分析測試學報,2011,30(9):1044-1049.

[11]徐雙雙,孫瑜,井鳳,等.硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離純化荷花中黃酮類化合物[J]. 色譜，2011,29(12):1244-1248.

[12]Wang X,Cheng CG,Sun QL,et al. Isolation and purification of four flavonoid constituents from the flowers ofPaeoniasuffruticosaby high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A,2005,1075(1-2):127-131.

[13]章光文,周國平,謝二磊,等. 山香圓葉中黃酮類成分研究[J]. 中國中藥雜志,2009,34(12):1603-1604.

[14]Sadtler R Lab. Sadtler Standard NMR Spectra[J]. Philadelphia:SadtlerRLabInc,1971:10229.

[15]Kubo M,Sasaki H,Endo T,et al. The constituents of Schizonepeta tenuifolia Briq. II Structure of a new monoterpene glucoside,schizonepetoside C[J]. Chem Pharm Bull,1986,34(8):3097-3101.

Rapid isolation of three bioactive components from the flowers ofPaeoniasuffruticosaAndr.

YAN Hui-jiao1,WANG Zhi-wei1,WANG Dai-jie1,AN Chun-yan2,GENG Yan-ling1,WANG Xiao1,*

(1.Shandong Analysis and Test Center,Shandong Key Laboratory Breeding Base of TCM Quality Control Technology,Ji’nan 250014,China; 2.Shandong Provincial Research Center for Bioinformatic Engineering and Technique,School of Life Sciences,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China)

The present article is to develop new methods for isolation and purification of bioactive components from the flowers ofPaeoniasuffruticosaAndr. by the combination of macroporous resin column chromatography and high-speed counter-current chromatography. The 70% ethanol extracts of peony flowers was separated by macroporous resin column chromatography and the objective fraction was obtained.Then the fraction was separated by HSCCC with ethyl acetate∶methanol∶butyl alcohol∶water=5∶1∶0.5∶4 two-phase system. The purities of the obtained compounds were determined by HPLC and their chemical structures were identified by1H NMR,13C NMR,MS. Three single compounds,apigenin-7-O-β-D-neospheroside,gallic acid and apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside were successfully obtained from Peony flowers and their purities were all over 95%. The developed method was effective in the isolation of flavonoids and phenolic acid from flowers ofPaeoniasuffruticosaAndr..

flowers ofPaeoniasuffruticosaAndr.;flavonoid;phenolic acid;isolation;high-speed counter-current chromatography

2016-12-12

閆慧嬌(1984-),女,博士,助理研究員,主要從事中藥學、天然產(chǎn)物化學方面的研究,E-mail:yanhuijiao01@163.com。

*通訊作者:王曉(1971-),男,博士,研究員,研究方向:天然產(chǎn)物化學及中藥資源,E-mail:wangx@sdas.org。

國家青年科學基金(21506119);山東省科學院青年基金項目(青基合字2015第002號)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)14-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.037