劉靄莎,洪啟恩,馮興江,毛祥飛,黃業(yè)福,邵遠(yuǎn)志,易美華,*(.海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司,海南?？?57000; .海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 57000)

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諾麗果、種子和葉提取物抑菌活性及復(fù)合植物抑菌液配方篩選

劉靄莎1,洪啟恩1,馮興江1,毛祥飛1,黃業(yè)福1,邵遠(yuǎn)志2,易美華2,*
(1.海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司,海南?？?570100; 2.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570100)

研究諾麗果、種子和葉提取物的抑菌活性。通過考察諾麗果發(fā)酵汁、種子乙醇提取物、種子水蒸餾提取物、諾麗葉提取物、金銀花提取物分別對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌4種致病菌的抑菌活性,篩選出了抑菌活性較強(qiáng)的3種提取物(諾麗果發(fā)酵汁、種子水蒸餾提取物、金銀花提取物)。通過單因素實驗、3因素3水平正交實驗,優(yōu)化了復(fù)合植物抑菌液的最佳配方。結(jié)果表明:以諾麗發(fā)酵汁87%、種子水蒸餾提取物8%、金銀花提取物5%制成的抑菌液,抑菌圈直徑分別為:銅綠假單胞菌15 mm,大腸埃希菌22 mm,金黃色葡萄球菌28 mm,變形鏈球菌17 mm。抑菌效果較好。結(jié)論:復(fù)合植物抑菌液具有抑菌的作用,為進(jìn)一步開發(fā)抑菌產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

諾麗,提取物,抑菌,致病菌,配方篩選

諾麗(Noni),學(xué)名Morindacitrifolia,又稱海濱木巴戟、海巴戟天、諾尼,為茜草科巴戟天屬灌木至小喬木,諾麗主要生長在南太平洋群島,在我國主要分布在臺灣、海南及西沙群島。

諾麗果在國外已成為一種常見的食品,特別是波利尼西亞等地區(qū),當(dāng)?shù)厝耸褂弥Z麗果已有兩千多年的歷史。研究表明,諾麗果富含20多種氨基酸、維生素C等多種營養(yǎng)成分[1],還含有多糖[2]、環(huán)烯醚萜[3]、蒽醌類[3]等多種有效成分,具有體外抗腫瘤、抗氧化、抑菌消炎等[4]活性;諾麗葉含有黃酮、皂甙、多糖等活性成分[1],種子含有甾醇類、東莨菪亭[5-6]等活性成分。目前,有關(guān)諾麗果汁和諾麗葉的提取物顯示良好的抑菌活性[7-8],金銀花中的綠原酸類成分有明顯的抗菌消炎活性等已有文獻(xiàn)報道[9],但諾麗種子的提取物抑菌未見報道。本文分別對諾麗果發(fā)酵原液、種子、葉、金銀花提取物的抑菌活性進(jìn)行研究,優(yōu)化較低濃度的復(fù)合植物抑菌液配方,為進(jìn)一步開發(fā)植物復(fù)合抑菌液提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾麗果、葉子 海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司;金銀花、鹽酸左氧氟沙星 購自當(dāng)?shù)厮幍?大腸埃希菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI) 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

H-1650高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;CH-9230旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海迅能電熱設(shè)備有限公司;發(fā)酵罐 溫州市億一機(jī)械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 各組分提取物的制備 諾麗果發(fā)酵汁:取一定量新鮮成熟的諾麗果于發(fā)酵罐中,密封室溫自然發(fā)酵40 d,取汁,過濾,取清液待用。

種子乙醇提取物:分離出諾麗種子,晾干,打碎,過40目篩,稱取20 g諾麗種子,按照1∶10 g/mL的料液比加95%乙醇溶液中,浸泡6 h后,抽濾清液,6000 r/min離心、60 ℃濃縮,收集油狀物質(zhì),待用。

種子水蒸餾提取物:稱取20 g諾麗種子,置于揮發(fā)油提取裝置,按1∶8加水加熱至沸騰,回流3 h,收集油狀物質(zhì),待用。

諾麗葉提取物:稱取500 g諾麗葉,烘干粉碎,加50%乙醇溶液40 ℃浸泡提取24 h,兩次提取液合并后6000 r/min離心、60 ℃濃縮,待用。

金銀花提取物:稱取100 g金銀花按諾麗葉提取物的提取方法得到提取物。

1.2.2 各提取物的單因素抑菌效果研究 以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌為供試菌,其中前3種是抑菌實驗常用致病菌,用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)進(jìn)行培養(yǎng),而后1種是口腔致齲主要病原菌,用腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)進(jìn)行培養(yǎng)。將供試菌的新鮮培養(yǎng)物1 mL置于培養(yǎng)皿,按照不同的菌種加等量的TSB或者BHI培養(yǎng)基迅速混勻,凝固后用打孔器在培養(yǎng)基中打孔,挑出培養(yǎng)基留下若干約10 mm的圓孔,向孔中加120 μL各提取物樣品。以鹽酸左氧氟沙星為陽性對照、無菌水為陰性對照。置于37 ℃培養(yǎng)12 h。如樣品有抑菌活性,則圓孔外會出現(xiàn)直徑大于10 mm的透明抑菌圈,量出抑菌圈的直徑記錄結(jié)果。

將1.2.1得到的5種提取物作為5個因素,每個因素按質(zhì)量百分比加水稀釋,取5個濃度進(jìn)行抑菌實驗,篩選出有抑菌活性的提取物。

1.2.3 提取物的復(fù)合配方抑菌研究 在1.2.2單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇三種提取物設(shè)計3因素3水平正交實驗(見表1)研究植物抑菌液的復(fù)配配方。

表1 正交實驗的因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 綠原酸含量檢測 按照GB/T 22250-2008的方法檢測上述諾麗葉、金銀花提取物的綠原酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

得到的結(jié)果借助正交設(shè)計助手2.0分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種提取物單因素抑菌研究

將5種提取物分別對4種供試菌進(jìn)行抑菌實驗,結(jié)果如表2所示。

由表2可知,諾麗果發(fā)酵液、諾麗種子水蒸餾提取物、金銀花提取物3種抑菌效果較好,其中諾麗果發(fā)酵液的抑菌效果隨濃度降低而降低,選擇100%、87%、75%進(jìn)入正交實驗。種子水蒸餾提取物的抑菌效果較好,對大腸埃希菌的抑制尤為突出,對銅綠假單胞菌的抑制稍差,但是該提取物得率很低,為了減輕生產(chǎn)成本在有效濃度范圍內(nèi)盡量選擇低的濃度,則選擇降低濃度8%、5%、2%進(jìn)入正交實驗。金銀花提取物對銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抑制較明顯,但是對變形鏈球菌的抑制稍差,選擇15%、10%、5%進(jìn)入正交實驗。其余兩種提取物需要較高濃度才有微弱的抑菌效果,故不考慮。

表2 5種提取物抑菌結(jié)果Table 2 The results of five kinds of extracts antimicrobial

表3 復(fù)合配方正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of composite formula

2.2 復(fù)合配方抑菌研究

根據(jù)表1的結(jié)果,選擇諾麗果發(fā)酵液、諾麗種子水蒸餾提取物、金銀花提取物3種,采用3因素3水平設(shè)計正交實驗,結(jié)果如表3所示。

使用正交分析軟件,計算結(jié)果見表4，銅綠假單胞菌,各因素主次順序為A>C>B,較優(yōu)配方組合為A3B1C3,其中7號實驗正是A3B1C3組合,并且可看出是所有實驗組中最優(yōu)配比。大腸埃希菌,各因素主次順序為C>B>A,較優(yōu)配方組合為A3B3C1,按A3B3C1進(jìn)行實驗,重復(fù)3次取平均值,得出抑菌圈為24 mm,同表3中的8號實驗組結(jié)果相同,故較優(yōu)組合為A3B3C1和A3B2C1。金黃色葡萄球菌,各因素主次順序為A>C>B,較優(yōu)配方組合為A3B3C1,按A3B3C1進(jìn)行實驗,重復(fù)3次取平均值,得出抑菌圈為29 mm,高出表3中任何一組實驗,故最優(yōu)組合為A3B3C1。變形鏈球菌,各因素主次順序為B>A>C,較優(yōu)配方組合為A2B3C1或A2B3C2,其中6號實驗正是A2B3C1組合,同時對A2B3C1和A2B3C2進(jìn)行實驗,重復(fù)3次取平均值,得出A2B3C1抑菌圈為18 mm,A2B3C2抑菌圈為17 mm,故最優(yōu)組合為A2B3C1。

綜合上述分析,結(jié)合產(chǎn)品的開發(fā)需求,用于對口腔致齲菌的抑制,優(yōu)先考慮抑制變形鏈球菌效果較好的6號實驗配方,即諾麗發(fā)酵液87%、種子水蒸餾提取物8%、金銀花提取物5%,該配方對另外3種致病菌雖然不是最優(yōu)配方,但是也有較好的抑制效果。

2.3 諾麗葉、金銀花的綠原酸含量

諾麗葉的綠原酸含量為24.2 mg/kg,金銀花的綠原酸含量為363.8 mg/kg。由此可知金銀花的綠原酸含量較高,實驗檢測結(jié)果也與文獻(xiàn)[10]報道符合,綠原酸是金銀花的主要抗菌、抗病毒有效藥理成分,具有廣泛的抗菌作用,和本實驗的結(jié)果相符合。諾麗葉的綠原酸含量較低,這可能是葉子提取物抑菌效果不明顯的原因。

表4 正交實驗結(jié)果分析Table 4 Analysis of orthogonal experimen results

3 結(jié)論

本實驗采用正交實驗設(shè)計,結(jié)合實際開發(fā)需求,主要抑制口腔致齲菌,初步選擇效果較好的組分比例為6號配方,即諾尼發(fā)酵液87%、種子水蒸餾提取物8%、金銀花提取物5%,抑菌圈直徑分別為:銅綠假單胞菌15 mm,大腸埃希菌22 mm,金黃色葡萄球菌28 mm,變形鏈球菌17 mm。

諾麗種子水蒸餾提取物即揮發(fā)油,主要是酯類物質(zhì),根據(jù)吳慧娟[11]等,抑菌作用位點(diǎn)可能位于細(xì)菌細(xì)胞膜上,破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層的完整性,引起細(xì)胞裂解,達(dá)到抑菌效果。

諾麗葉的綠原酸含量較低,目前的提取方法不能得到含量較高的提取物,抑菌效果不理想,今后需要進(jìn)一步改進(jìn)提取工藝。

諾麗作抑菌實驗已有報道,李金霞[7]等利用諾麗十倍濃縮液能有效抑制食源性致病菌;龔敏[12]等報道諾麗果汁的乙酸乙酯和正丁醇萃取段具有明顯的抑菌作用;諾麗提取物凝膠能抑制糞腸球菌生長[13];Zhang[8]等報道諾麗葉的正丁醇等有機(jī)溶劑提取物也有很好的抑菌效果。本實驗利用諾麗發(fā)酵原液而非濃縮液,配合種子和金銀花的水提取物組成復(fù)合植物配方液,成分安全,抑菌效果較好,相比市面上應(yīng)用廣泛的氯己定類口腔護(hù)理產(chǎn)品在牙齒上會留痕跡、不美觀,諾麗傳統(tǒng)的抗菌消炎作用,為日后開發(fā)口腔護(hù)理產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

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Study on antimicrobial properties of Noni fruit,seed and leaf extract and screening of antimicrobial composite formula

LIU Ai-sha1,HONG Qi-en1,FENG Xing-jiang1,MAO Xiang-fei1, HUANG Ye-fu1,SHAO Yuan-zhi2,YI Mei-hua2,*

(1.Hainan Noni Biological Engineering Development Co.,Ltd.,Haikou 570100,China; 2.College of Science and Technology,Hainan University,Haikou 570100,China)

The paper researched the antimicrobial properties of extracts of Noni fruit,seed and leaf extract. By studying the antimicrobial properties of Noni fruit fermented juice,seed ethanol extract,seed steam distillate extract,Noni leaf extract and honeysuckle extract respectively on four kinds of pathogens as the target,Pseudomonas aeruginosa,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Streptococcusmutans,three kinds of extracts with stronger antimicrobial properties(Noni fruit fermented juice,seed steam distillate extract and honeysuckle extract)were screened out. Through the experimental results from the single factor experiment and three factors three levels orthogonal experiments,the best formula of compound plant bacteriostatic liquid was optimized. The results showed that the antimicrobial effect of liquid mixed from 87% of the Noni fruit fermented juice,8% of the distilled steam extract and 5% of the honeysuckle extract was the best. The inhibition zone diameters of different bacteria were 15 mm ofPseudomonasaeruginosa,22 mm ofEscherichiacoli,28 mm ofStaphylococcusaureus,17 mm ofStreptococcusmutans. The compound plant bacteriostatic liquid has antimicrobial effect,and it provides theoretical basis for further developing antimicrobial product.

Noni;extract;antimicrobial;pathogens;prescription screening

2016-12-20

劉靄莎(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物,E-mail:liuaisha2@foxmail.com。

*通訊作者:易美華(1945-)，女，大學(xué)本科，教授，研究方向:食品資源開發(fā)利用,E-mail:ymh12@163.com。

海南省重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(ZDYF2016175)專項資助。

TS201.1

A

1002-0306(2017)14-0171-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.034