張曦文,趙 博,張國財(cái),劉春延,李文娟(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

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富硒對蛹蟲草菌絲干重及胞內(nèi)酶活性的影響

張曦文,趙 博,張國財(cái)*,劉春延,李文娟
(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的Na2SeO3液體培養(yǎng)蛹蟲草,探究富硒對蛹蟲草菌絲干重及胞內(nèi)酶活性的影響,并進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果表明:當(dāng)硒添加量為3 mg/kg時(shí),菌絲干重達(dá)1.51 g/100 mL,較對照組高19.84%;當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),菌絲干重較對照組低4.76%,過高的硒添加量會抑制蛹蟲草的生長。適宜的硒添加量能在不同程度上提高胞內(nèi)酶活性,但促進(jìn)效果存在差異。菌絲干重與蛋白酶活性呈正相關(guān)(p<0.01),R2=0.980,表明蛋白酶是富硒蛹蟲草生長中的關(guān)鍵酶。當(dāng)硒添加量為3 mg/kg時(shí),菌絲干重及蛋白酶活性均達(dá)到最大值,可以為富硒蛹蟲草液體發(fā)酵提供理論依據(jù)。

富硒,蛹蟲草,胞內(nèi)酶活性,菌絲干重

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Vuill.)Fr.]是麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)的模式種[1],富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等多種對人體有益的活性物質(zhì)及微量元素,是冬蟲夏草的理想替代品[2]。硒(Selenium,Se)是人體必需的微量元素之一,在延緩衰老、防癌抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮著重要作用[3]。目前,世界各地普遍存在硒攝入量不足的問題,缺硒會引發(fā)多種疾病,但無機(jī)硒難以直接吸收,且具有一定的毒性,因此,開發(fā)有機(jī)富硒保健品勢在必行[4]。近年來,富硒酵母[5]、富硒茶葉[6]、富硒大米[7]、富硒食用菌[8]等富硒食品的開發(fā)取得了一定的進(jìn)展。富硒食用菌是一種將無機(jī)硒與食用菌有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物,可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒,使硒更容易被人體組織儲存和吸收,是人體良好的補(bǔ)硒劑[9-12]。許多科研工作者對富硒蛹蟲草進(jìn)行了較深入的研究,包括富硒蛹蟲草栽培技術(shù)、活性成分及藥理作用等[13-18],但對富硒蛹蟲草胞內(nèi)酶活性機(jī)理的研究未見報(bào)道。因此,系統(tǒng)地研究硒濃度對蛹蟲草胞內(nèi)酶活性的影響,對富硒蛹蟲草保健品的開發(fā)具有重要的理論價(jià)值和生產(chǎn)實(shí)踐意義[19-21]。本文擬在培養(yǎng)基中添加Na2SeO3溶液培養(yǎng)蛹蟲草,探究富硒對蛹蟲草菌絲干重及胞內(nèi)酶活性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草母種 由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;無水亞硒酸鈉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BiofugeStratos高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司;DK-S14型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-5100 型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;F-2500型熒光分光光度計(jì) 日立公司;SHB-ⅢA型循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富硒蛹蟲草培養(yǎng)基的制備 配方組成:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,維生素B150 mg/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉3 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂1 g/L,配制培養(yǎng)液[22]。在培養(yǎng)液中添加Na2SeO3溶液,使培養(yǎng)液Na2SeO3終濃度分別為0、1、3、5、7 mg/kg。用500 mL三角瓶分裝培養(yǎng)液,每瓶250 mL,121 ℃滅菌20 min后備用。

1.2.2 菌株活化及培養(yǎng)

1.2.2.1 菌株活化 在超凈工作臺中,將菌種接種于培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂粉16 g/L,蛋白胨5 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂1 g/L的平面培養(yǎng)基中,22 ℃條件下培養(yǎng)10 d,制得活化菌株。

1.2.2.2 菌株培養(yǎng) 在無菌條件下,將各活化后的菌株用打孔器打成大小相同直徑為5 mm菌塊,并分別接種于不同Na2SeO3終濃度的富硒培養(yǎng)液及不加Na2SeO3的對照培養(yǎng)液中,每菌株設(shè)置重復(fù)3個(gè),每瓶接入菌塊3個(gè),并置于搖床中在20 ℃,160 r/min條件下,恒溫振蕩培養(yǎng)[22]。

1.2.3 菌絲干重測定 按1.2.2方法連續(xù)培養(yǎng)蛹蟲草4 d,真空抽濾培養(yǎng)液,并用等量的蒸餾水清洗3次,將所得菌絲置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,分析天平稱量即為菌絲干重,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 菌絲總硒含量測定 根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定[23]。

1.2.5 粗酶液的制備及胞內(nèi)酶活測定

1.2.5.1 粗酶液的制備 按時(shí)觀察1.2.2中培養(yǎng)的菌絲,待菌絲萌發(fā)后開始取樣,取樣時(shí)間間隔為12 h。具體方法是將培養(yǎng)的樣品分裝到50 mL離心管中,于4 ℃條件下10000 r/min離心15 min后棄上清液,合并菌絲,而后再用等量蒸餾水清洗菌絲三次后,將菌絲置于冰浴磷酸緩沖液中研磨破壁。吸取研磨勻漿,離心后上清液即得所需粗酶液[22]。

1.2.5.2 胞內(nèi)酶活測定 蛋白酶采用福林酚法測定[24],即在試管中加入預(yù)熱的2%酪蛋白溶液及粗酶液各1 mL,混合均勻后40 ℃恒溫水浴10 min,取出后立即加入0.4 mol/L三氯醋酸溶液2 mL以終止反應(yīng)。離心后取上清液0.5 mL并依次加入2.5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液及0.5 mL福林酚工作液40 ℃恒溫水浴顯色20 min,而后于680 nm測定吸光度。以每毫升樣品與底物反映10 min改變0.01個(gè)吸光度作為一個(gè)酶活力單位進(jìn)行酶活計(jì)算。淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶均采用南京建成生物研究所試劑盒測定,按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒對蛹蟲草菌絲干重及總硒量的影響

2.1.1 硒對菌絲干重的影響 由圖1可知,在相同條件下,不同硒添加量培養(yǎng)蛹蟲草,菌絲干重隨硒添加量的增加整體呈先上升后下降趨勢,即當(dāng)硒添加量為1～3 mg/kg時(shí),菌絲干重隨硒添加量的增加而增加,3 mg/kg菌絲干重達(dá)1.51 g/100 mL,相比對照組提高了19.84%。當(dāng)硒添加量為5 mg/kg時(shí),菌絲干重相比硒添加量為3 mg/kg降低了1.99 %,但仍高于對照組。當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),菌絲干重僅為1.20 g/100 mL,相比對照組降低了4.76%,對蛹蟲草菌絲生長顯示出了明顯的抑制作用。方差分析結(jié)果表明,5個(gè)處理組菌絲干重間均存在顯著差異。因此,僅以菌絲產(chǎn)量單因素分析,在進(jìn)行蛹蟲草富硒培養(yǎng)時(shí),發(fā)酵液中最佳硒濃度為3 mg/kg。

圖1 不同硒添加量菌絲干重Fig.1 Mycelial dry weight in different amount of selenium注:小寫字母表示差異在0.05水平顯著,圖2～圖7同。

2.1.2 硒對總硒含量的影響 由圖2可知,蛹蟲草具有較強(qiáng)的富硒能力,通過發(fā)酵液中添加硒可以提高菌絲中的硒含量,且硒含量與添加量呈正相關(guān)。當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),菌絲硒含量最高,為165.23 mg/kg。方差分析表明,各處理組間硒含量均存在顯著差異。

圖2 不同硒添加量的總硒含量Fig.2 The total selenium content of different selenium additions

2.2 硒對蛹蟲草菌絲胞內(nèi)酶活性的影響

2.2.1 硒對胞內(nèi)蛋白酶活性的影響 由圖3可知,當(dāng)硒添加量為1、3、5 mg/kg時(shí),其酶活高峰相比對照組分別提高了16.48%、25.82%、2.60%,富硒液體發(fā)酵有利于提高蛹蟲草菌絲細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性。當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵對蛹蟲草菌絲蛋白酶活性前期有抑制作用，后期有增強(qiáng)作用。由此說明,適宜低濃度的Na2SeO3可以促進(jìn)蛹蟲草胞內(nèi)蛋白酶的分泌,提高酶的活性。其中當(dāng)硒添加量為3 mg/kg時(shí),促進(jìn)效果最為顯著。

圖3 不同硒添加量液體培養(yǎng)蛹蟲草胞內(nèi)蛋白酶活性變化趨勢Fig.1 Changes of protease activity in C.militaris under different selenium additions

2.2.2 硒對胞內(nèi)淀粉酶活性的影響 由圖4可知,在整個(gè)液體培養(yǎng)過程中,5個(gè)處理組的蛹蟲草胞內(nèi)淀粉酶活性整體變化趨勢基本一致,即酶活性自培養(yǎng)的開始階段便快速分泌,直至第60 h大部分出現(xiàn)酶活高峰,隨后即有所下降,至第84 h后出現(xiàn)另一酶活高峰。

圖4 不同硒添加量液體培養(yǎng)蛹蟲草胞內(nèi)淀粉酶活性變化趨勢Fig.4 Changes of intracellular amylase activity of C.militaris cultured with different selenium additions

當(dāng)硒添加量為1～7 mg/kg時(shí),從培養(yǎng)中期開始蛹蟲草胞內(nèi)淀粉酶活性均高于對照組。其中,以硒添加量5 mg/kg處理組促進(jìn)作用最明顯,酶活高峰達(dá)0.2264 U,相比對照組和其他處理組分別提高了22.78%、12.52%、6.64%、12.47%。與對照相比，當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),36～48 h促進(jìn)作用不顯著,但后期促進(jìn)作用顯著,表現(xiàn)出了明顯的滯后性,這與蛋白酶活性測定結(jié)果相似。由此說明,當(dāng)硒添加量為1～7 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵均有利于提高蛹蟲草菌絲細(xì)胞內(nèi)淀粉酶活性,促進(jìn)作用隨著硒添加量的增加呈先上升后下降趨勢,以5 mg/kg處理組效果最為顯著。

2.2.3 硒對胞內(nèi)多酚氧化酶活性的影響 由圖5可知,在整個(gè)培養(yǎng)過程中,5個(gè)處理組的蛹蟲草多酚氧化酶活力變化趨勢基本保持一致,自培養(yǎng)開始酶活力逐漸升高,1、3、5 mg/kg及對照組至84 h達(dá)到活性頂點(diǎn)隨后下降。7 mg/kg處理組酶活至84 h時(shí),酶活快速上升,顯示出了明顯的滯后性。

圖5 不同硒添加量液體培養(yǎng)蛹蟲草胞內(nèi)多酚氧化酶活性變化趨勢Fig.5 Changes of intracellular polyphenol oxidase activity in C.militaris under different selenium additions

當(dāng)硒添加量為1、3、5 mg/kg時(shí),其多酚氧化酶高峰活性均顯著高于對照組,相比對照組分別提高了134.85%、100%和67.43%;而當(dāng)亞硒酸鈉濃度為7 mg/kg時(shí),其多酚氧化酶活性在發(fā)酵前72 h均略低于對照組,此后酶活性快速增加,并顯著高于對照組酶活性。由此可知,當(dāng)亞硒酸鈉濃度為1～5 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵可顯著提高多酚氧化酶的活性,且硒添加量為1 mg/kg時(shí)提高效果最明顯;而當(dāng)亞硒酸鈉濃度為7 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵對蛹蟲草菌絲細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶活性在發(fā)酵初期具有一定的抑制作用,后顯示出促進(jìn)作用。

2.2.4 硒對胞內(nèi)過氧化物酶活性的影響 由圖6可知,蛹蟲草富硒液體發(fā)酵過程中,當(dāng)硒添加量為1～7 mg/kg時(shí),蛹蟲草胞內(nèi)過氧化物酶活性變化整體趨于一致,均于72 h達(dá)到酶活高峰,隨后緩慢下降。與此同時(shí),1、3、5 mg/kg處理組其胞內(nèi)過氧化物酶活性均高于對照組,5 mg/kg處理組酶活最高,其酶活峰值達(dá)63.20 U,相比1、3 mg/kg及對照組分別提高了6.81%、4.26%、9.08%。當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),相比對照組酶活性有所降低,顯示出了一定的抑制作用。由此說明,當(dāng)硒添加量為1、3、5 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵均可促進(jìn)蛹蟲草胞內(nèi)過氧化物酶的分泌,提高其活性,但當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),富硒液體發(fā)酵對蛹蟲草菌絲胞內(nèi)過氧化物酶活性具有抑制作用。

表1 蛹蟲草胞內(nèi)酶活性與菌絲干重相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis within intracellular enzyme activities and mycelial dry weight of C. militaris

圖6 不同硒添加量液體培養(yǎng)蛹蟲草胞內(nèi)過氧化物酶活性變化趨勢Fig.6 Changes of peroxidase activity in C. militaris under different selenium additions

注:**表示在0.01水平顯著。

2.2.5 硒對胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響 由圖7可知,富硒液體發(fā)酵過程中,蛹蟲草菌絲細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性隨著時(shí)間推移整體呈下降趨勢。在1～7 mg/kg的范圍內(nèi),隨著硒添加量的增加，超氧化物酶活性峰值隨濃度增大而增大,且均高于對照組超氧化物歧化酶活性,在24 h時(shí)相比對照組分別增加了1.54%、2.38%、3.50%、22.37%。由此說明,硒添加量為1～7 mg/kg范圍內(nèi)時(shí),富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)可以提高超氧化物歧化酶的活性,且亞硒酸鈉濃度越高,富硒液體發(fā)酵對超氧化物歧化酶活性提高效果越顯著。

圖7 不同硒添加量液體培養(yǎng)蛹蟲草胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性Fig.7 Effects of different selenium additions on the activity of superoxide dismutase in C.militaris

2.3 相關(guān)性分析

由表1可知，蛋白酶活性、淀粉酶活性、多酚氧化酶、過氧化物酶活性與菌絲干重呈正相關(guān),且蛋白酶活性與菌絲干重在0.01水平極顯著。說明這四種酶對菌絲的生長有一定的促進(jìn)作用,蛋白酶與菌絲干重的關(guān)系更為密切,蛋白酶是富硒蛹蟲草液體培養(yǎng)的關(guān)鍵酶。結(jié)合圖1和圖7可知,當(dāng)硒添加量為1～5 mg/kg時(shí),超氧化物歧化酶活性和菌絲干重隨著硒添加量的增大而增大,呈正相關(guān);當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),超氧化物歧化酶活性依然在上升,但菌絲干重下降,可能是因?yàn)榫z受到不利因素的影響導(dǎo)致菌絲干重下降,從而促進(jìn)保護(hù)性的超氧化物歧化酶分泌。

3 討論與結(jié)論

食用菌生長發(fā)育與胞內(nèi)酶的分泌及活性變化存在重要關(guān)系,研究食用菌胞內(nèi)酶活性的變化對篩選優(yōu)良菌株,提高菌株產(chǎn)量和品質(zhì)有重要意義[25-26]。在硒添加量為3 mg/kg時(shí),菌絲干重較對照組高19.84%。當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),菌絲干重僅為1.20 g/100 mL,較對照組低4.76%,較高硒添加量對蛹蟲草菌絲生長顯示了明顯的抑制作用。

富硒能促進(jìn)蛹蟲草胞內(nèi)蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性,可促進(jìn)酶的分泌及增強(qiáng)酶的活性[27-28]。不同硒添加量對酶的作用效果存在差異性,當(dāng)硒添加量為1 mg/kg時(shí),多酚氧化酶高峰活性較對照組高134.85%;當(dāng)硒添加量為3 mg/kg時(shí),蛋白酶活性高峰較對照組高25.79%;當(dāng)硒添加量為5 mg/kg時(shí),淀粉酶和過氧化物酶活性高峰較對照組分別高22.78%和9.08%;當(dāng)硒添加量為7 mg/kg時(shí),超氧化物歧化酶高活性峰較對照組高22.37%。其原因可能是無機(jī)硒通過培養(yǎng)基進(jìn)入菌絲體后轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒,促進(jìn)菌絲生長,從而增強(qiáng)了酶的活性。

通過對蛹蟲草菌絲干重與胞內(nèi)酶活性相關(guān)性分析表明:菌絲干重與胞內(nèi)蛋白酶活性呈顯著正相關(guān)(p<0.01),表明蛋白酶是富硒蛹蟲草液體發(fā)酵的關(guān)鍵酶。其原因是蛋白質(zhì)是菌絲中硒結(jié)合的主要營養(yǎng)物質(zhì),富硒會促進(jìn)硒與蛋白質(zhì)結(jié)合,增強(qiáng)了蛋白酶活性[29]。蛹蟲草菌絲干重與蛋白酶、淀粉酶、多酚過氧化物酶及過氧化物酶活性均呈正相關(guān),而超氧化物歧化酶活性呈負(fù)相關(guān),這可能是因?yàn)槌趸锲缁甘潜Ｗo(hù)性酶,當(dāng)這種酶活性變強(qiáng),說明菌絲受到不利因素的影響,過高的硒濃度對菌絲產(chǎn)生一定的抑制作用,導(dǎo)致菌絲干重下降。

綜上所述,適當(dāng)?shù)奈砑恿靠纱龠M(jìn)蛹蟲草菌絲生長,提高蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)量,提高胞內(nèi)酶活性。蛋白酶是富硒蛹蟲草生長中的關(guān)鍵酶,當(dāng)硒添加量為3 mg/kg時(shí),菌絲干重及蛋白酶活性達(dá)到最大值,研究結(jié)果可為富硒蛹蟲草液體發(fā)酵提供理論依據(jù)。

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Effects of selenium enrichment on mycelia dry weight and intracellular enzyme activity ofCordycepsmilitaris

ZHANG Xi-wen,ZHAO Bo,ZHANG Guo-cai*,LIU Chun-yan,LI Wen-juan

(College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

The effects of selenium enrichment on the mycelia dry weight and intracellular enzyme activity ofCordycepsmilitariswere investigated and the correlation analysis was carried out by adding different concentrations of Na2SeO3liquid to the culture medium. The results showed that when the selenium content was 3 mg/kg,the dry weight of mycelium was 1.51 g/100 mL,which was 19.84% higher than that of the control.When the selenium content was 7 mg/kg,the dry weight of mycelium was 4.76% lower than that of the control.Excessive selenium addition inhibits the growth ofCordycepsmilitaris. The suitable amount of selenium additions could increase the activity of intracellular enzymes in different extent,but the promoting effect was different. At thep<0.01 level,the dry weight of mycelia was positively correlated with the protease activity,R2=0.980,indicating that protease was the key enzyme in the growth of Se-enrichedCordycepsmilitaris.When the selenium content was 3 mg/kg,the mycelium dry weight and protease activity reached the maximum value,which could provide the theoretical basis for liquid fermentation of selenium-enrichedCordycepsmilitaris.

selenium-enriched;Cordycepsmilitaris;intracellular enzyme activities;mycelial dry weight

2017-01-05

張曦文(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食用菌栽培及藥理，E-mail：zxw920427@163.com。

*通訊作者:張國財(cái)(1964-)，男，博士，研究方向：食用菌栽培技術(shù)，E-mail：zhang640308@126.com。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2572014AA08)。

TS209

A

1002-0306(2017)14-0151-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.030