何曉靜，鐘毅欣，蔣 偉,馬紹勇,趙 靜，卓 穎*

(1.重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶400010)

(2.重慶市納米材料及傳感技術工程實驗室，西南大學化學化工學院，重慶400715)

基于目標物引發(fā)的滾環(huán)擴增信號放大策略構建電致化學發(fā)光傳感器用于m icroRNA檢測

何曉靜1*，鐘毅欣1，蔣 偉1,馬紹勇2,趙 靜2，卓 穎2*

(1.重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶400010)

(2.重慶市納米材料及傳感技術工程實驗室，西南大學化學化工學院，重慶400715)

該實驗設計了基于目標物循環(huán)引發(fā)滾換擴增（CI-RCA）的電致化學發(fā)光（ECL）傳感器。首先，設計了由結合區(qū)域與多鳥嘌呤區(qū)域兩部分組成的啞鈴型掛鎖探針作為滾環(huán)擴增模板。該模板中的結合區(qū)域能夠與目標miRNA以及固載電極表面的引物雜交形成三元“Y”形結構，進而引發(fā)滾環(huán)擴增，產(chǎn)生連環(huán)的多胞嘧啶序列的單鏈DNA。當滾環(huán)擴增完成對模板的一次復制時，目標miRNA被置換下來，進而協(xié)助下一條引物與模板的結合，引發(fā)下一個滾環(huán)擴增，生成大量的引物3端延伸出的多胞嘧啶DNA單鏈?；贑-Ag-C的配位作用，Ag+被固定在電極表面，進而增強過硫酸根體系的ECL信號。因此，隨著目標miRNA濃度的增加，ECL信號強度越高。實驗結果表明該傳感器在1.0 fmol/L～1.0 nmol/L濃度范圍內對miRNA有良好的線性響應。

電致化學發(fā)光；滾環(huán)擴增；miRNA

0 引言

滾環(huán)擴增 （rolling circle amplification，RCA）是新近發(fā)展起來的一種恒溫核酸擴增方法[1]。以環(huán)狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物（與部分環(huán)狀模板互補），在酶催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復的模板互補片段。這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現(xiàn)對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測領域具有廣闊的應用潛力[2]。在之前的基于滾環(huán)擴增的信號放大策略中，以目標物直接作為引物或者構建一個目標物循環(huán)產(chǎn)生引物再進行滾環(huán)擴增是常用的方法。以目標物直接在作為引物的方法具有操作簡單的優(yōu)勢，在均相體系，如熒光檢測中廣泛運用，然而在電化學，表面等離子共振等需要固載界面的體系中受到限制。最近的研究指出，級聯(lián)目標物循環(huán)的滾環(huán)擴增雖然能夠解決界面固載的問題，但同時也讓操作變得復雜[3-4]。在此，提出了一種基于鏈置換的目標物循環(huán)與滾環(huán)擴增同步進行的新型信號放大策略。

電致化學發(fā)光（Electrochemiluminescence,簡稱ECL）是電化學與化學發(fā)光相結合的檢測技術，它具有儀器設備簡單、操作方便、易于實現(xiàn)自動化、靈敏度高、選擇性高、重現(xiàn)性好、抗干擾能力強、線性響應范圍寬和分析速度快等特點[5-6]。因此，近些年來ECL分析技術被廣泛地應用于分析檢測領域，特別是將該技術與生物識別和傳感技術相結合構建了一系列生物傳感器，實現(xiàn)了對細胞、蛋白質、核酸的靈敏檢測。常見的電致化學發(fā)光試劑主要有S2O82-、Ru(bpy)32+及其衍生物、Luminol及其衍生物、半導體納米材料如量子點等[7]。相比其他發(fā)光體系之下S2O82--O2體系廉價而穩(wěn)定但是存在不容易固載的問題。因此，常以共反應試劑（如苝四甲酸及其衍生物）作為信號標記物或S2O82-僅作為共反應試劑[8]。Au對S2O82--O2體系有強烈的增強，與Au性質相近的Ag可能同樣具有增強作用。而Ag可以與胞嘧啶(C)作用形成“C-Ag-C”的穩(wěn)定結構，因此，Ag+固載于多胞嘧啶的核酸序列有望構建一種簡單廉價的S2O82--O2電致化學發(fā)光體系。

在該實驗中，設計了基于目標物循環(huán)引發(fā)滾換擴增（CI-RCA）的ECL傳感器用于microRNA（miRNA）檢測。首先，精心設計了由結合區(qū)域與多鳥嘌呤區(qū)域兩部分組成的啞鈴型掛鎖探針作為滾環(huán)擴增模板。結合區(qū)域能夠與目標miRNA以及固載電極表面的引物雜交形成三元“Y”形結構，進而引發(fā)滾環(huán)擴增，產(chǎn)生連環(huán)的多胞嘧啶序列的單鏈DNA。當滾環(huán)擴增完成對模板的一次復制時，目標miRNA被置換下來，進而協(xié)助下一條引物與模板的結合，引發(fā)下一個滾環(huán)擴增，生成大量的引物3端延伸出的多胞嘧啶DNA單鏈?；贑-Ag-C的配位作用，Ag+被固定在電極表面，進而增強過硫酸根體系的ECL信號。因此，隨著目標miRNA濃度的增加，ECL信號強度越高。實驗表明該傳感器在目標物濃度為1.0 fmol/L～1.0 nmol/L的范圍內具有良好的線性響應，檢測限為0.32 fmol/L，信噪比為S/N=3。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型ECL分析儀 （西安瑞邁電子科學技術有限公司），CHI610A電化學工作站（上海辰華儀器公司），BRANSONIC 200超聲清洗儀 （德國BRANSON ULTRASCHALL公司）；TGL-20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。三電極體系：1、玻碳電極（GCE，Φ=4mm）及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極；2、玻碳電極 （GCE，Φ=4 mm）及其修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對電極。移液槍（成都方舟科技開發(fā)公司）和SCZL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器用于適體Ⅱ制備過程的加樣和攪拌。

氯鉑酸（HPtCl6，0.1mol/L）；過硫酸鈉（分析純A.R.）；Tris-HCl緩沖溶液 （pH7.4）；1μmol/L AgNO3溶液；1%BSA溶液；1U/μLPhi29 DNA聚合酶;25mmol/L dNTP mixture溶液；10U/μL T4 DNA連接酶；磷酸緩沖溶液 （PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1mol/LNa2HPO4，0.1mol/L KH2PO4和0.1mol/LKCl混合配制而成；所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級純，實驗用水均為二次去離子水。所用到的寡聚核酸序列如表1所示。

1.2 傳感器組裝

將裸電極打磨洗凈,采用電位溶出分析的方法，電位設置為-0．25 V，沉積時間為30 s,于氯鉑酸（HPtCl6，0．1mol/L）溶液中沉積鉑。用去離子水漂凈后，滴加10μL的1μmol/LCP（TE buffer，pH8．0）于電極表面，在常溫下修飾1 h。然后，用去離子水漂凈，滴加10μLMCH溶液（1mmol/L, 75%乙醇）封閉非特異性結合位點，并活化組裝在沉積鉑表面的CP。電極制備過程示意圖見圖1。

表1 寡聚核酸序列Tab.1 Sequence information for the nucleic acidsused in this study

1.3 目標物引發(fā)的滾環(huán)擴增過程

PP溶液的處理：將PP探針在12000 r/min下離心20min，用Tris-HCl緩沖液（pH8．0）溶解，配成100μmol/L溶液。然后在95℃退火5min。目標物引發(fā)的滾環(huán)擴增過程：加酶緩沖,將2μL 1U/ μL Phi29 DNA聚合酶、4μL 25 mmol/L dNTP mixture溶液、2μL 10U/μLT4DNA連接酶、2μL的1μmol/LPP、6μL不同濃度的miRNA混合搖勻制得20μL體系。滴加10μL的20μL體系溶液于傳感器表面在30℃下溫育2．5 h后，用去離子水漂凈。滾環(huán)擴增過程示意圖請見圖1插圖。

1.4 ECL檢測

滴加10μL的1×10-6mol/LAgNO3溶液于擴增之后的傳感器表面，室溫下靜置1 h后用去離子水漂洗。于含有0．1mol/LK2S2O8的0．1mol/L PBS（pH7．4）底液中，運用循環(huán)伏安法進行ECL檢測。實驗參數(shù)設置為：光電倍增管高壓800 V，掃描速率0．2 V/s，電位-2～0 V。

圖1 傳感器的制備過程示意圖Fig．1 Schematic diagram of the stepwise sensor construction process

2 結果與討論

2.1 界面的電化學表征

交流阻抗譜作為一種有效檢測修飾電極表面膜的界面性質的手段。圖2裸電極上進行逐層修飾過程的Faradaic阻抗表征圖譜。圖2中a是裸電極阻抗變化的曲線，b是裸電極修飾鉑后阻礙電極表面電子轉移，阻抗增大；c曲線是CP后相對于b電極表面存在較大的電子轉移電阻，阻抗增大；d、e曲線二者半圓直徑發(fā)生急劇增加，表明d曲線是MCH封閉后阻抗明顯較c增強，e曲線則是吸附目標物后電極表面的鏈增長可顯著降低界面上的電子轉移率，說明傳感器成功組裝并且滾環(huán)擴增成功進行。

通過循環(huán)伏安實驗用于檢測電極表面逐級修飾過程（如圖3所示）。循環(huán)伏安曲線圖a為裸電極在[Fe(CN)6]3-/4-中氧化還原曲線；修飾鉑后促進電極表面電子轉移增加表面積，電流減小（曲線b）；組裝引物CP后由于DNA的負電性與[Fe(CN)6]3-/4-之間排斥作用，電流減小；MCH封閉后阻礙作用增強，電流繼續(xù)減小，e曲線則是吸附目標物后電極表面的鏈增長可顯著降低界面上的電子轉移率，電流進一步降低。同樣說明傳感器成功組裝且滾環(huán)擴增成功進行。

圖2 在10mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的電化學阻抗譜圖(a)裸電極，(b)納米鉑修飾電極，(c)修飾了CP，(d)修飾了MCH,(e)修飾了20μL體系溶液(含目標物miRNA)Fig.2 The characterization ofEISin 10mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(a.bare GCE,b.Pt/GCE,c.CP/Pt/GCE, d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/GCE)

圖3 在10mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的循環(huán)伏安曲線圖(a)裸電極，(b)納米鉑修飾電極，(c)修飾了CP，(d)修飾了MCH,(e)修飾了20μL體系溶液(含目標物miRNA)Fig.3 The characterization ofCV(a.bare GCE,b.Pt/GCE, c.CP/Pt/GCE,d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/ GCE)

2.2 修飾電極的ECL表征

將修飾電極在濃度為0.1mol/L的S2O82-的檢測底液中運用循環(huán)伏安法進行ECL檢測，其ECL響應變化可以表征傳感器的制備過程。如圖4所示：裸電極在S2O82-溶液產(chǎn)生的ECL信號較高（曲線a），據(jù)文獻報道，它主要是由于S2O82--O2體系的發(fā)光。當鉑固載到電極表面后，由于鉑、CP、MCH等不能夠增強S2O82--O2體系的發(fā)光，使得ECL信號變化不明顯 （曲線b、c、d）。當復合物miRNA孵育到修飾電極上，由于miRNA引發(fā)滾環(huán)擴增，因此ECL信號明顯降低（e曲線）。

圖4 傳感器制備過程ECL表征（a.裸電極，b.Pt/裸電極，c.CP/Pt/裸電極，d.MCH/CP/P裸電極，e.miRNA/ MCH/CP/Pt/裸電極）Fig.4 ECL characterization ofsensor preparation process (a.bare GCE,b.Pt/GCE,c.CP/Pt/GCE,d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/GCE)

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 修飾CP的時間優(yōu)化

讓CP修飾時間分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h于[Fe(CN)6]3-/4-中測CV。圖5表明CP修飾1～2.5 h內電流值經(jīng)歷了先減小后增大的趨勢，再結合時間因素考慮，1 h是CP修飾的較好時間且不影響實驗效果。故選定CP修飾時間為1 h。

圖5 CP修飾時間不同對膜電流的影響Fig.5 Different to the influence ofmembrane currentCP modification time

2.3.2 修飾20微升體系后時間優(yōu)化

讓10μL的20μL體系溶液于30℃下修飾時間分別為3 h、6 h、9 h于S2O82--O2體系測ECL。圖6表明修飾時間明顯是3 h時ECL信號最強，故選定修飾20μL體系溶液的時間為3 h。

2.4 修飾電極的ECL線性

優(yōu)化條件下,在電極表面修飾不同濃度的miRNA溶液，于0．1mol/LK2S2O8（pH7．4，PBS）的檢測底液中，在-2．0～0 V范圍內進行ECL檢測，結果如圖7所示。實驗結果表明，在1．0×10-15～1．0×10-9mol/L的濃度范圍內，ECL響應信號與miRNA濃度成線性關系。其線性回歸方程為：y= 7966．14286+516．43 lg c（c為miRNA的濃度），相關系數(shù)為r2=0．9985。

圖6 20μL體系修飾時間不同對ECL信號的影響Fig．6 Effectsof incubation timeon ECL intensity of the sensor

圖7 （A）傳感器對不同濃度miRNA的ECL響應和（B）ECL強度相對于miRNA濃度對數(shù)的校準曲線Fig．7 (A)ECL intensity of the proposed biosensor incubated with differentconcentration of themiRNA:1．0×10-9mol/L,1．0×10-10mol/L,1．0×10-11mol/L,1．0×10-12mol/L,1．0×10-13mol/L,1．0×10-14mol/L,1．0×10-15mol/L(from a to g)．(B)Relationship between the ECL intensity and the logarithm of the concentration ofmiRNA

2.5 ECL傳感器的選擇性

分別用blank(BSA代替)、10-6mol/L oligo 1、10-6mol/Loligo 2、（oligo 1,oligo 2,miRNA）混合物代替20μL體系溶液中miRNA，同時10-9mol/L miRNA的20μL體系溶液作對照。如圖8,BSA代替miRNA作為空白時ECL信號很低,同樣的用oligo 1、oligo 2代替miRNA時的ECL信號也很低，而含有目標物miRNA及 （oligo 1,oligo 2, miRNA）混合物的ECL信號很高，說明該實驗ECL傳感器對目標物miRNA具有較好的選擇性。

3 結論

圖8 ECL傳感器的選擇性Fig．8 The selectivity ofECL sensors

在該實驗中設計了基于目標物循環(huán)引發(fā)滾換擴增的電致化學發(fā)光傳感器。實驗結果表明，隨著目標物miRNA濃度的增加，ECL信號強度越高，通過測量ECL信號就能夠實現(xiàn)對miRNA濃度的檢測。電致化學發(fā)光試驗表明在miRNA濃度為1.0 fmol/L～1.0 nmol/L的范圍內，該傳感器的ECL信號隨目標物miRNA濃度增加而增強，表現(xiàn)出良好的線性關系。當高濃度的干擾DNA序列共存時，目標物miRNA的ECL響應信號依然高出干擾DNA序列好幾倍，說明該傳感器能夠對目標物miRNA實現(xiàn)高靈敏度，高選擇性的檢測。

[1]劉青杰,陳德清.滾環(huán)DNA擴增技術及其應用[J].輻射研究與輻射工藝學報,2007,25(1):5-9.

[2]LiM M,LiF,Zhang ZQ,etal.Rolling Circle Amplification:a Versatile Tool for Chemical Biology,Materials Science and Medicine[J].Chem.Soc.Rev,2014,43: 3324.

[3]李啟明,馬學軍.RCA技術的應用及研究進展[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2006,20:99-100.

[4]喬婉瓊,周東蕊,楊耀,等.滾環(huán)擴增原理及其在醫(yī)藥領域的應用[J].中國藥科大學學報,2006,37(3):201-205.

[5]廖玉紅.基于Nafion為基體的復合膜構建的電化學免疫傳感器和電致化學發(fā)光適體傳感器的研究[D].重慶:西南大學,2012.4-18.

[6]王曉英.基于電致化學發(fā)光技術的納米生傳感器的設計與研究[D].上海:華東師范大學,2008.1-2.

[7]Jie G,Liu P,Zhang S.Highly Enhanced Electrochemiluminescence of Novel Gold/Silica/CdSe-CdSnanostructures for Ultrasensitive Immunoassay of Protein Tumor marker[J].Chem.Commun.,2010,46:1323-1325.

[8]Ma M N,Zhang X,Zhuo Y,etal.An Amplified Electrochemiluminescent Aptasensorusing Au Nanoparticles Capped by 3,4,9,10-perylene Tetracarboxylic Acidthiosemicarbazidefunctionalized C60Nnanocomposites As SignalEnhancement[J].Nanoscale.,2015,7(5):2085-2092.

A novelelectrochem ilum inescenc biosensor wasapplied form icroRNA detection based on cyclic binding-induced rolling circleamplification(CI-RCA)strategy

He Xiao-jing1*,Zhong Yi-xin1,JiangWei1,Ma Shao-yong2,Zhao Jing2,Zhuo Ying2*
(1.Institute ofUltrasound Imaging ofChongqingMedicalUniversity,The Second Affiliated HospitalofChongqing MedicalUniversity,Chongqing 400010,China)
(2.Chongqing Nanomaterialsand Sensing Technology Engineering Laboratory,College ofChemistry and Chemical Engineering,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

In thiswork,an electrochemiluminescenc(ECL)biosensorbased on cyclic binding-induced rolling circle amplification(CI-RCA)strategywas firstproposed and applied in ECLbiosensor formicroRNA(miRNA)detection. Herein,a dumbbell-like padlock probewas elaborated with the combination ofguanine-rich sequence and binding region.The targetmiRNA acted asa binderwhich supported the hybridization of the primer and the padlock probe. Then the rolling circle amplification was triggered and the targetmiRNA would be released on accountof the strand displacementpolymerization and join into another reaction cycle.Asa result,large amountof cytosine-riched DNA single strandswere synthesized on the surface of the biosensor.As the specific affinitywith cytosine,silver ionswere assembled on the biosensor,which efficiently enhanced the ECL emission of the peroxydisulfate/oxygen(S2O82-/O2) system.Hence,the concentration of target miRNA could be read out through the ECL intensity.With the amplification of CI-RCA,the biosensor required very simple operations and demonstrated ultrasensitive response to targetmiRNA.The ECL assay formiRNA-21 detection is developed with excellent sensitivity of a concentration variation from 1.0 fmol/L to 1.0 nmol/L and limitofdetection down to 0.3 fmol/L.

electrochemiluminescence;rolling circle amplification;miRNA

國家自然科學基金青年科學基金項目(81401382)；重慶市衛(wèi)生計生委醫(yī)學科研項目(2016MSXM024)

*通信聯(lián)系人，E-mail:He_xiaojing1006@163.com,Tel.:Fax:023-63693060