陳茂鑫，周 瑩，袁 若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

基于AgNCs-Ce:ZONPs發(fā)光復(fù)合納米材料的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器對腫瘤標(biāo)志物靈敏檢測的研究

陳茂鑫，周 瑩，袁 若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

該研究以含有鈰的氧化鋅復(fù)合納米材料（Ce:ZONPs）為固載基質(zhì)，以BSA作為模板和還原劑在Ce: ZONPs表面原位合成銀納米簇（AgNCs）制得發(fā)光復(fù)合納米材料（AgNCs-Ce:ZONPs），并以此作為信號(hào)探針構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）免疫傳感器用于癌胚抗原（CEA）的靈敏檢測。在該工作中，BSA作為天然蛋白質(zhì)，表面含有大量的氨基和巰基，介于共價(jià)鍵Ag-N和Ag-S，BSA可以作為優(yōu)良的納米簇配體。同時(shí)通過BSA的成膜性，制備BSA功能化的Ce:ZONPs，從而在Ce:ZONPs@BSA的表面生成大量、粒徑小于2 nm的AgNCs，獲得高效、穩(wěn)定的電致化學(xué)發(fā)光。最后利用該復(fù)合物上BSA剩余的氨基與anti-CEA（Ab2）中的羧基交聯(lián)，從而制備出AgNCs-Ce:ZONPs/Ab2探針。電極敏感界面的構(gòu)建是在裸玻碳電極上修飾一層功能化BSA的TiO2納米復(fù)合物（TiO2@BSA），提供充足的活性位點(diǎn)來固載anti-CEA（Ab1），從而制得了ECL免疫傳感器?；趭A心型反應(yīng)模式，此免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對CEA的靈敏檢測，線性范圍2.5 ng/mL至80 ng/mL。

銀簇；發(fā)光復(fù)合納米材料；夾心免疫法；癌胚抗原；電致化學(xué)發(fā)光

0 引言

癌 胚 抗 原[1-3]（carcino-embryonic antigen CEA）是一種分子量為150～300 kD的糖蛋白，主要是由胎兒時(shí)期的內(nèi)胚層衍生出來的胃腸道及肝胰合成。CEA是臨床上極有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物之一，當(dāng)某些惡性腫瘤細(xì)胞基因受到損傷后，可能重新啟動(dòng)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，致使腫瘤患者血清中CEA的濃度升高。因此，測定腫瘤患者血清中CEA的濃度，對于監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等有一定的參考價(jià)值。

迄今為止，檢測CEA的化學(xué)方法主要有熒光免疫分析法[4]、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法[5]、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法等[6]。熒光免疫分析法存在的主要問題是抗原或者抗體在標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)后發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后的性能可能改變，并且每次標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的標(biāo)記率很大?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析保留了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度，但是酶的催化效果受外界條件的影響較大，不穩(wěn)定。而電致化學(xué)發(fā)光免疫分析有其突出的優(yōu)點(diǎn)，如標(biāo)記物穩(wěn)定，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)多元檢測及均相免疫分析，因而日益受到重視。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗原、半抗原及抗體等的免疫檢測。

電致化學(xué)發(fā)光分析[7]（ECL）是對電極施加一定的電壓，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在電極表面發(fā)生電子傳遞反應(yīng)而產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)躍遷回到基態(tài)時(shí)輻射出光子發(fā)光，最后用光電倍增管捕獲和測量發(fā)光光譜和強(qiáng)度，進(jìn)而對物質(zhì)進(jìn)行痕量分析的一種方法。電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的檢測技術(shù)，它具有儀器設(shè)備簡單、操作方便、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、靈敏度高、選擇性高、重現(xiàn)性好、抗干擾能力強(qiáng)、線性響應(yīng)范圍寬和分析速度快等特點(diǎn)。常見的電致化學(xué)發(fā)光試劑[8]主要有Ru(bpy)32+及其衍生物[9]、Luminol[10]及其衍生物和半導(dǎo)體納米材料、貴金屬納米簇如銀簇（Silver cluster,AgNCs）等。但是常用的量子點(diǎn)，如CdTe，CdS，CdSe等，其固有的毒性在一定程度上限制了量子點(diǎn)在生物中的應(yīng)用，因此，發(fā)展新的低毒或無毒的具有電致化學(xué)發(fā)光（ECL）性質(zhì)材料至關(guān)重要。貴金屬納米簇由于量子限域效應(yīng)，具有不連續(xù)的尺寸相關(guān)的電子能級，因而表現(xiàn)出類分子性質(zhì)，如較高的催化活性、熒光等，這使得銀納米簇在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出巨大的潛力[11]。此外，銀納米簇還具有一些優(yōu)越的性質(zhì)，如制備簡單，實(shí)用性好，低毒性，生物相容性，表面功能化簡單以及良好的穩(wěn)定性，這些性質(zhì)極大地?cái)U(kuò)大了銀納米簇在生物分析中的應(yīng)用前景。

該文以CEA為蛋白質(zhì)模型，構(gòu)建了一種基于AgNCs的電致化學(xué)發(fā)光超靈敏免疫傳感器。該實(shí)驗(yàn)首先合成BSA功能化的Ce:ZONPs，隨后利用BSA外面的氨基和巰基與Ag+通過Ag-N和Ag-S鍵連接，制備出AgNCs-Ce:ZONPs復(fù)合物，再利用該復(fù)合物上BSA剩余的氨基與anti-CEA（Ab2）中的羧基交聯(lián)，從而制備出AgNCs-Ce: ZONPs/Ab2探針，該探針具有很強(qiáng)的ECL信號(hào)，用于提高檢測的靈敏度，作為該實(shí)驗(yàn)的一大亮點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對一定濃度范圍內(nèi)的CEA檢測。實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)此原理制備的電極可以有效的檢測CEA，檢測限低，靈敏度高，線性范圍寬，結(jié)果令人滿意。

免疫傳感器的制備過程為：首先將功能化BSA的二氧化鈦納米復(fù)合物（TiO2@BSA）滴涂于干凈玻碳電極的表面，由于TiO2具有較大的比表面積[12-13]從而增大了抗體固載量，同時(shí)能提供和人體相似的微環(huán)境以保持固定分子的生物活性。接著，由于氨基和羧基之間共價(jià)鍵作用，利用BSA和anti-CEA（Ab1）中的酰胺鍵作用來固定Ab1。利用夾心模型，一抗-抗原-二抗的作用，將AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2生物探針固載到修飾電極表面，實(shí)現(xiàn)了對CEA的檢測。該生物探針固載了大量的AgNCs發(fā)光試劑，結(jié)合較低濃度的過硫酸根（S2O82-）作為共反應(yīng)試劑，得到強(qiáng)的ECL信號(hào)，提高傳感器的檢測靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限公司、中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所）；CHI610A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；FA-2004A FA/JA系列電子天平（Metter Toledo公司）；BRANSONIC 200超聲清洗儀（德國BRANSON ULTRASCHALL公司）；烘箱；反應(yīng)釜移液槍（成都方舟科技開發(fā)公司）。JBZ-12H磁力攪拌器；三電極體系：玻碳電極（GCE，Φ=4mm）及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極。癌胚抗原酶結(jié)合物（Ab1, Ab2）和癌胚抗原（CEA）（鄭州賽博生物工程有限責(zé)任公司提供）；磷酸鹽緩沖液 （PBS）（pH= 7．4，0．1mol/L）；AgNO3、Zn(NO3)2、Ce(NO3)2、半胱氨酸（0．1mol/L）、賴氨酸（0．1mol/L）、鐵氰化鉀（化學(xué)試劑有限公司 （中國四川））、牛血清白蛋白（BSA,96%～99%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC）（延長生化技術(shù)有限公司-上海）,N-羥基琥珀酰亞胺 （NHS）（延長生化技術(shù)有限公司-上海），甲胎蛋白（AFP）（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司），Na2S2O8（上?？颠_(dá)氨基酸廠）、草酸鈦鉀、雙氧水（30%）、氫氧化鈉（1 mol/L）、濃鹽酸、硼氫化鈉、醋酸，其他試劑如Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl均為分析純試劑。實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

1.2 AgNCs的制備

AgNCs根據(jù)先前報(bào)道的方法[14],經(jīng)過適當(dāng)修改合成。首先用二次去離子水配置10mLZn(NO3)2溶液（6mmol/L）、500μLCe(NO3)3溶液、1mL半胱氨酸 （0．1mol/L），隨后在80°C下混合攪拌2 h，然后向其中加入5mL賴氨酸（0．1mol/L）,攪拌5min后，放入反應(yīng)釜中，在180°C下反應(yīng)2 h，便制得了Ce:ZONPs，自然冷卻后，用二次去離子水離心洗滌兩次，重新將Ce:ZONPs分散于二次去離子水中，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其次，取500μLCe:ZONPs稀釋至2mL，再加入2mL 3%BSA和EDC/NHS（1mg:4mg），4℃攪拌2 h，然后向其中滴加2 mL AgNO3（10 mmol/L）、100μLNaOH溶液（1mol/L），在25℃下攪拌12 h，用二次去離子水離心洗滌并分散于二次去離子水中，放置于4℃下避光保存。

1.3 AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2生物探針的制備

取1．5mL已制備好的AgNCs-Ce:ZONPs@BSA加入干凈的燒杯中，加入EDC/NHS（1mg:4mg）、二抗（Ab2）300μL，在4℃下避光攪拌過夜后，便制得AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2溶液，離心后重新分散在二次去離子水中，置于4℃下避光備用。

1.4 TiO2@BSA復(fù)合納米材料的制備

首先，在一個(gè)典型的過程中[15]，將8mL草酸鈦鉀直接溶解在8mL 30%的H2O2中，混合、攪拌5min,然后用濃鹽酸調(diào)至pH=4,激攪30min，至溶液呈暗紅色，放入反應(yīng)釜中加熱0．5 h，4℃冷藏備用。稱取0．5 g BSA用適量水，超聲震蕩使之完全溶解后定容至10mL刻度，制備得到5%的BSA溶液，4℃冷藏備用。取1mLBSA加入到3 mL二氧化鈦中，25℃下攪拌2 h后，制得TiO2@BSA復(fù)合納米材料。

1.5 傳感器的制備

玻碳電極（Φ=4mm）經(jīng)0．3、0．05μm的Al2O3糊拋光2min后用蒸餾水沖洗干凈，再在蒸餾水水中超聲洗滌3min，清洗后的電極置于室溫下晾干備用。

吸取5μL TiO2@BSA分散好的溶液滴涂于預(yù)處理后的玻碳電極表面，于室溫下（在適當(dāng)?shù)臏囟认律晕⒂脽艄饧訜峥杉涌斐赡ぃ┝栏沙赡ぁＴ诘玫降男揎楇姌O表面滴加10μL的Ab1，在4℃下孵育12 h，用蒸餾水淌洗，在電極表面滴加10μL不同濃度的CEA，孵育2 h后淌洗，于電極上滴入10μL AgNCs-Ce:ZnO@BSA放置1 h后淌洗，制得修飾電極。傳感器的制備過程如圖1。

1.6 測試方法

該實(shí)驗(yàn)測量采用三電極體系：玻碳電極（Φ= 4mm）為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl溶液）作為參比電極，鉑絲為對電極。 在2mL含有0．01 mol/LNa2S2O8的0．1mol/LPBS（pH=7．4）溶液中，采用MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對所修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究。電位掃描范圍為-2 V～0 V，以100mV/s電位掃描速度施加循環(huán)伏安（CV）掃描模式和電致化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測，除特別說明溫度均控制為室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ce:ZONPs形貌表征

將AgNCs-Ce:ZONPs@BSA進(jìn)行SEM表征，由圖2可以觀察到，Ce:ZONPs明顯的呈現(xiàn)圓球狀，直徑略大于1μm。

2.2 修飾電極的CV表征和ECL表征

圖1 ECL免疫傳感器的制備過程示意圖Fig.1 The schematic diagramsof the ECL immunosensor

圖2 Ce:ZONPs的SEM表征Fig.2 Ce:ZONPscharacterization ofSEM

在含有0．1mol/L的Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中，-0．2 V～0．6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）電化學(xué)表征。在2 mL含有0．01 mol/L Na2S2O8的0．1mol/LPBS（pH=7．4）溶液中,-2 V～0 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測。由圖3可以觀察到，裸電極（曲線a）在測試底液中有一對對稱的可逆氧化還原峰。在修飾了TiO2@BSA后，電極（曲線b）響應(yīng)有一定幅度的降低,因?yàn)門iO2@BSA阻礙了電子傳遞率。當(dāng)電極孵育Ab1后，由于蛋白質(zhì)大分子阻礙了電子傳輸，電流減弱（曲線c），且ECL信號(hào)弱（曲線e）。當(dāng)電極孵育上CEA后，與抗體Ab1結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，進(jìn)一步阻礙了電子傳輸，峰電流值降低（曲線d）。當(dāng)電極孵育上Ab2復(fù)合物后，該傳感器具有很好的ECL信號(hào)（曲線f）。

2.3 免疫傳感器的響應(yīng)性能

在最優(yōu)條件下，采用電致化學(xué)發(fā)光對免疫傳感器的響應(yīng)性能進(jìn)行考察。如圖4所示。將修飾了不同濃度CEA的免疫傳感器（Ab2/AgNCs/Ce: ZnOPs@BSA/CEA/Ab1/TiO2@BSA）在0.01 mol/L的Na2S2O8溶液中進(jìn)行檢測，測得對應(yīng)的穩(wěn)定后的ECL強(qiáng)度隨著抗原濃度的不斷增加而逐漸增加。該傳感器在2.5 ng/mL至80 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程：I＝-249 lg c+4071（c為CEA的濃度ng/mL），相關(guān)系數(shù)為r =0.9974，檢測限為0.83 ng/mL，信噪比為S/N=3。

2.4 免疫傳感器的選擇性

此外，對傳感器的選擇性進(jìn)行了考察。將傳感器的目標(biāo)物分別更換為4%的AFP、空白、40 ng/mL的CEA以及三者的混合物。從圖5可以看出，含有CEA的目標(biāo)物具有很好的ECL信號(hào)，而不含CEA的目標(biāo)物幾乎沒有信號(hào)，表明該免疫傳感器具有很好的選擇性。

2.5 免疫傳感器的穩(wěn)定性

同時(shí)，還對該免疫傳感器的操作穩(wěn)定性進(jìn)行了評估。將免疫傳感器在0.01mol/L緩沖溶液中進(jìn)行連續(xù)10圈的ECL掃描。從圖6可以看出，其ECL響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.61%，表明傳感器對CEA的檢測具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 加標(biāo)回收

圖3 A傳感器的CV表征（a.裸電極；b.TiO2@BSA/裸電極；c.Ab1/TiO2@BSA/裸電極；d.ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸電極）；B傳感器的ECL信號(hào)（a.ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸電極；b.Ab2/ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸電極）Fig.3 ACyclic voltammogramsofvariousmodified electrodes in 0.1mol/LK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6solution: (a)bareGCE;(b)TiO2@BSA/GCE；(c)Ab1/TiO2@BSA/GCE;(d)CEA/TiO2@BSA/GCE;BECLsignal: (a).CEA/Ab1/TiO2@BSA/GCE；(b).Ab2/CEA/Ab1/TiO2@BSA/GCE

圖4 A ECL信號(hào)（CEA的濃度分別為a.2.5 ng/mL，b.5 ng/mL，c.10ng/mL，d.20 ng/mL，e.40 ng/mL，f.80 ng/mL）;B線性擬合圖表Fig.4 A ECL signal(CEA concentrationwerea.2.5 ng/mL,b.5 ng/mL,c.10 ng/mL,d.20 ng/mL,e.40 ng/mL, f.80 ng/mL);B Linear fitting chart

圖5 ECL信號(hào)選擇性（CEA溶液的濃度為40 ng/mL）Fig.5 ECL signalselectivety(CEA solution concentration were40 ng/mL)

圖6 ECL信號(hào)穩(wěn)定性（CEA溶液的濃度為10 ng/mL）Fig.6 ECL signalstability(CEA solution concentration were 10 ng/mL)

通過重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)評估了該新開發(fā)的癌胚抗原生物傳感器的應(yīng)用潛力。實(shí)驗(yàn)操作為：先將癌胚抗原用健康人類血清樣稀釋至不同濃度，然后，孵育在生物傳感器的敏感界面上，通過ECL檢測，從而評估血清樣本對癌胚抗原的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。重現(xiàn)值控制在91．56%到106．73%之間,這表明,用該生物傳感器檢測血清樣本的癌胚抗原是有應(yīng)用潛力的。

表1 臨床血清樣本分析Tab.1 Clinicalserum sam p lesanalysis

3 結(jié)論

綜上所述，該文利用Ce:ZONPs作為AgNCs固載基質(zhì)合成了一個(gè)新型信號(hào)探針AgNCs-Ce: ZONPs，并構(gòu)建了高靈敏的免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對CEA的檢測。值得一提的是，通過BSA中大量的巰基和羧基在Ce:ZONPs的表面合成AgNCs，與此同時(shí)，通過酰胺化反應(yīng)合成AgNCs-Ce:ZONPs/ Ab2最后通過抗原抗體的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了將銀簇固載在電極上，并且在S2O82-的催化下傳感器獲得良好的ECL相應(yīng)。基底材料TiO2具有大比表面積和良好的生物兼容性，使得修飾電極表面能吸附大量抗體并很好地保持其生物活性，基于夾心免疫反應(yīng)，CEA免疫傳感器在2．5 ng/mL～80 ng/mL檢測范圍內(nèi)令人滿意的分析性能，以及良好的穩(wěn)定性。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，該免疫傳感器將在疾病診斷和臨床分析領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。

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Electrochem ilum inescence immunoassay for sensitive detection of cancermarkersbased on AgNCs-Ce:ZONPs lum inescent nanocom posites

Chen Mao-xin,Zhou Ying,Yuan Ruo*
(SchoolofChemistry and ChemicalEngineering,SouthwestUniversity,Chongqing 400715,China)

In thiswork,the electrochemiluminescentnanocompositewas proposed through AgNCs in situ generating on the surface ofbovine serum albumin(BSA)functionalized zinc oxide containing cerium.Notably,BSA as stabilizing agentprovided abundantbinding sites to potentially bind and further reduce Ag ions for generating AgNCs. The AgNCs-TiO2NFs composites achieved highly efficient ECL,biocompatibility,ease of labeling and easy filmforming.In view of these advantages,the compositescould have greatpotentialasa signalprobe to constructelectrochemiluminescence(ECL)immunesensor for detection of carcinoembryonic antigen(CEA).Meanwhile,the nanocomposites(TiO2@BSA)weremodified onto the surface ofa glassy carbon electrode(GCE),which afforded a large surface area foranchoringmassive Ab1 via CO-NH bonding.Based on the“sandwich reaction”strategy,this immunesensorprovided an ultrasensitive ECL detection ofCEAwith a linear response from 2.5 ng/mL to 80 ng/mL.

AgNCs;luminescent nanocomposites(AgNCs-Ce:ZONPs@BSA);sandwich immunoassay;CEA; electrochemiluminescence(ECL)

*通信聯(lián)系人,E-mail:yuanruo@swu.edu.cn