□ 劉暢 鞍山市食品藥品檢驗所

HPLC法測定玉米中的玉米赤霉烯酮含量

□ 劉暢 鞍山市食品藥品檢驗所

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會污染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等谷物。本文主要通過對國標(biāo)檢測方法的優(yōu)化，對濃縮重溶等方式建立分析方法，保證了上機檢測濃度，提高了檢測效率，使回收率和精密度均滿足國標(biāo)GB/T 27404-2008的要求。

玉米赤霉烯酮 玉米 高效液相色譜法

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會污染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等谷物。ZEA具有和雌激素類似的結(jié)構(gòu)，可與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素效應(yīng)，其作用強度為雌激素的十分之一。ZEA可引起卵巢病變，干擾動物排卵、延長發(fā)情間期、減少胎仔數(shù)或引起不孕等[1]。

我國規(guī)定谷物及其制品中的玉米赤霉烯酮限量指標(biāo)為小于等于60μg/kg[2]，一般采用液相色譜、氣相色譜和試劑盒等方法進行檢測。

本文通過對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.209-2016[3]/第一法進行優(yōu)化，分別對方法檢出限濃度、定量限濃度、限量指標(biāo)濃度等進行加標(biāo)實驗，結(jié)果表明，用HPLC法進行ZEA質(zhì)量濃度的測定，回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008[4]的要求。

1 試劑和材料

超純水、乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、ZEA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（PriboLab）、提取液（乙腈：水=84:16，v/v）[5]、PBS緩沖液（Hyclone）、吐溫-20、ZEA免疫親和柱（Romer）。

2 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀、熒光檢測器、離心機、氮吹儀。

3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.0001g)，用乙腈溶解，配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃以下避光保存。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動相稀釋，配制成10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

4 實驗方法

4.1 提取

本次實驗采用市售玉米碴，經(jīng)過高速粉碎機粉碎后，準(zhǔn)確稱取5g（0.001g）放于50mL離心管中，加入20mL提取液，渦旋振蕩2min后，置于離心機中，8000rpm離心10min。上清液通過玻璃纖維濾紙過濾，棄去初濾液3mL，收集余下濾液。準(zhǔn)確吸取3mL濾液于50mL離心管中，加入25mL PBS緩沖液，混勻。

4.2 凈化

將免疫親和柱恢復(fù)至室溫后與固相萃取裝置連接，再將上樣器連接于小柱上端，加入樣品與PBS混合液，使混合液緩慢通過小柱，棄去流出液。待混合液完全流出小柱時，先向上樣器中加入10mL0.1%吐溫-20進行淋洗，再加入10mL水繼續(xù)淋洗，棄去全部流出液。最后將小柱下方連接5mL收集管，用0.5mL甲醇洗脫3次，收集洗脫液。

4.3 濃縮

將收集到的1.5mL左右的洗脫液于低于45℃氮氣緩緩吹干，再用流動相重新溶解并定容至1mL，過0.22μmPTFE濾膜，待上機。

4.4 空白試驗

不稱取樣品，按4.1～4.3的步驟做空白試驗。

4.5 色譜條件

色譜柱：迪馬科技C18色譜柱，4.6mm×150mm，5μm；流動相：乙腈+水+甲醇=46+46+8，體積比；流速：1mL/min；檢測波長：激發(fā)波長274nm，發(fā)射波長440nm；進樣量：40μL；柱溫：35℃。

5 結(jié)果與討論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5.1和5.2可以看出，在ZEA的濃度為10ng/mL～500ng/mL范圍內(nèi)，y=0.037x-0.059，r=0.99998。因此，可以用外標(biāo)法進行ZEA質(zhì)量濃度的測定。ZEA的質(zhì)量濃度=（峰面積+0.059）/0.037。

5.2 回收率與精密度

本次實驗中，空白試驗與樣品中均未檢出ZEA。加標(biāo)試驗結(jié)果見表5.1。

5.3 討論

本次實驗較之國標(biāo)方法，減少了取樣量以及上機檢測的進樣量，通過濃縮重溶等方式保證了上機檢測濃度，提高了檢測效率。加標(biāo)試驗結(jié)果可達到國標(biāo)GB 5009.209-2016[3]/第一法的檢出限，并滿足GB/T 27404-2008對方法確認的要求，證明本方法在實驗室中檢測玉米中的ZEA含量是可行的。參考文獻：

圖5.1

圖5.2

[1] 高爽，梁珍，鄧俊良，楊顏銥，陳蕓.玉米赤霉烯酮和脫氧血腐鐮刀烯醇對雌性動物的生殖毒性及作用機制，動物營養(yǎng)學(xué)報，2016,28（4）：1042-1049.

[2] 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量，GB 2761-2011.

[3] 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定，GB 5009.209-2016.

[4] 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測，GB/T 27404-2008附表F.1和F.2.

[5] 朱孟麗，彭聰，洪振濤.高效液相色譜法對飼料中玉米赤霉烯酮的測定，飼料工業(yè)，2007年第28卷第1期，37-38.

表5 .1 加標(biāo)試驗結(jié)果