蘇圣淞, 周國英, 李 河, 王 姣, 何苑皞, 劉君昂

(中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室, 中南林業(yè)科技大學(xué)森林有害生物防控湖南省重點實驗室, 長沙 410004)

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土沉香根結(jié)線蟲病的病原鑒定

蘇圣淞, 周國英*, 李 河, 王 姣, 何苑皞, 劉君昂

(中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室, 中南林業(yè)科技大學(xué)森林有害生物防控湖南省重點實驗室, 長沙 410004)

本研究對海南省澄邁縣土沉香根結(jié)線蟲病危害與發(fā)生情況進行了調(diào)查與研究,并采用比較形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNA-ITS序列分析的方法對病原進行了分離鑒定,確定了發(fā)生在澄邁縣土沉香苗木上的根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲MeloidogyneenterolobiiYang & Eisenback。這是首次報道海南省澄邁地區(qū)土沉香上發(fā)生象耳豆根結(jié)線蟲,為進一步分析土沉香病原根結(jié)線蟲種群及該病的防治研究奠定了基礎(chǔ)。

土沉香; 象耳豆根結(jié)線蟲; rDNA-ITS

土沉香Aquilariasinensis,亦稱白木香,俗稱女兒香、莞香,屬瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilariaspp.,其木材因飽含樹脂而質(zhì)量大,遇水即沉,且芳香之極。土沉香是我國特有的珍貴樹種,也是生產(chǎn)中藥沉香的唯一植物資源[1],現(xiàn)已被列為國家珍稀瀕危三級保護植物[2]及國家二級重點保護野生植物[3]。土沉香主要分布于我國華南地區(qū),以海南、廣東、云南、福建、廣西、臺灣等省區(qū)為主,其中海南種植面積最廣,已成為我國沉香的代表性產(chǎn)區(qū)[4]。土沉香的人工種植在海南已經(jīng)十余年,種植面積已超過2 000 hm2,遍布海南省各個市縣。

2013年在海南省19個市(縣)對包括土沉香在內(nèi)的10個鄉(xiāng)土樹種的主要病蟲害進行了調(diào)查,結(jié)果表明?？?、屯昌、五指山、定安、東方、澄邁、保亭、萬寧、昌江、三亞等地的土沉香均受到根結(jié)線蟲的危害而呈現(xiàn)植株長勢差、葉片失綠黃化、易感葉部病害等癥狀,尤其是部分苗圃基地的苗木感病嚴重,死亡率極高,達40%～60%。

我們在調(diào)查土沉香根結(jié)線蟲發(fā)生情況的基礎(chǔ)上,進一步對土沉香病原根結(jié)線蟲進行分離、鑒定。通過對澄邁縣主要土沉香育苗基地受根結(jié)線蟲的危害情況調(diào)查及其病原根結(jié)線蟲的分離鑒定,對土沉香苗木根結(jié)線蟲病的發(fā)病癥狀進行了較為詳細的闡述,并確定了澄邁地區(qū)一種新的土沉香病原根結(jié)線蟲。

1 材料與方法

1.1 材料

病株樣品:在海南省澄邁地區(qū)主要土沉香育苗基地(以海南國營澄邁林場為主)采集染病袋裝苗連同基質(zhì)一起放入封口袋內(nèi),做好標記帶回實驗室。

供試番茄苗:市場采購的普通櫻桃番茄種子,在滅菌土中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 土沉香根結(jié)線蟲病的調(diào)查及供試蟲源準備

在海南省澄邁縣土沉香主要育苗基地對土沉香苗木根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況展開調(diào)查。在顯微鏡下從采集的染病袋裝苗上挑取單卵塊接種在滅菌土中,將剛長出兩片真葉的番茄幼苗移入接種土中培養(yǎng),進行種群純化培養(yǎng)與活體保存[5]。

1.2.2 土沉香根結(jié)線蟲的獲得

雌蟲的分離與收集:經(jīng)單卵塊接種后的番茄苗培養(yǎng)40 d后,取侵染的番茄根用清水洗凈,在體視顯微鏡下用鑷子或解剖針針尖將根結(jié)表皮輕輕挑開,剖面出現(xiàn)的乳白色的光滑梨形物即為根結(jié)線蟲的雌蟲,用解剖針輕輕撥出,放入水中待用。

2齡幼蟲的收集:2齡幼蟲由單卵塊孵化獲得,參照王曦茁等的方法[6]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

雌成蟲與2齡幼蟲的主要形態(tài)特征觀察:包括雌成蟲頭部、口針特征等;2齡幼蟲頭部、尾部特征等。分別測量20條成蟲與2齡幼蟲的體長、最大體寬、口針長和DEGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)等形態(tài)指標。

雌成蟲會陰花紋的制作與觀察:參照張紹升的方法[7],從新鮮的染病番茄根組織挑取成熟雌蟲,置于滴有40%乳酸溶液的載玻片上,在體視顯微鏡下,用解剖針和雙面刀切取下尾端(蟲體后部約1/4處),將尾端的體內(nèi)組織用發(fā)針去掉,并切除尾端表皮多余部分,把會陰花紋部分轉(zhuǎn)移至滴有純甘油的載玻片上展平,制成臨時玻片在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

根結(jié)線蟲DNA提取,參照王曦茁等[6]與章淑玲等[8]的方法,稍作修改:配制線蟲裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,1 mmol/L EDTA pH 8.0, 0.25 mmol/L NaCl pH 8.0, 1% SDS),5℃保藏,待用。在體視顯微鏡下挑取單條成熟雌成蟲,置于滴有無菌水的載玻片上,用無菌水沖洗3次后,轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL離心管中,加入10 μL無菌水,4 μL預(yù)冷的裂解液,用滅菌解剖針將雌蟲刺破,加入2 μL的1 mg/mL 蛋白酶K(天根公司),并迅速放入-20℃冰箱中過夜。然后置于65℃水浴鍋中1 h,95℃水浴10 min使蛋白酶變性,最后以12 000 r/min離心2 min,取其上清用于PCR擴增或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因選擇及目的片段擴增與測序:參照王曦茁等[6]、Shi 等[9]的研究結(jié)果,對所分離篩選獲得的根結(jié)線蟲,選擇核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進行擴增與測序,PCR擴增引物為 V5367: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′和26S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′[9],由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系及條件參見王曦茁等的方法[6]。PCR產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建:將本試驗分離的根結(jié)線蟲ITS序列(編號為HN150805),與GenBank數(shù)據(jù)庫中根結(jié)線蟲ITS序列進行比對分析,分別選取南方根結(jié)線蟲M.incognitaITS序列(KP751204、KP179223),北方根結(jié)線蟲M.haplaITS序列(LC030362、LC030358),花生根結(jié)線蟲M.arenariaITS序列(LC03035、LC030356),爪哇根結(jié)線蟲M.javanicaITS序列(AF387094、AY829375),西班牙根結(jié)線蟲M.hispanicaITS序列(EU443614、EU443612),象耳豆根結(jié)線蟲ITS序列(KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369),以秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans(X03680)的ITS序列作為外群,共16個序列,采用MEGA 5.1軟件通過鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以自展法(bootstrap)進行1 000次循環(huán)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 土沉香根結(jié)線蟲發(fā)病癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn)澄邁縣的部分土沉香育苗基地的土沉香1年生小苗或2年生大袋苗出現(xiàn)植株矮小,葉片黃化失綠,生長緩慢,甚至植株枯死的現(xiàn)象,且罹病苗木易患其他葉部病害,嚴重苗圃死亡率達40%～60%。受害土沉香苗木根部會形成許多大小形狀不定、表面粗糙的根結(jié),有的連接成塊,隨著病情的加重,根部壞死表現(xiàn)為疏松多孔,大部分2年生的罹病大袋苗的根頸部會形成畸形的瘤塊,有的瘤塊處的直徑是正常處2倍多,表皮縱裂。取根結(jié)在體視顯微鏡下切開能看見白色梨形雌蟲,或取受害土沉香苗土用貝曼漏斗處理約24 h,鏡檢會觀察到大量線形幼蟲或雄蟲。

圖1 土沉香苗木根結(jié)線蟲危害狀Fig.1 Symptoms of damage by root-knot nematode in Aquilaria sinensis seedlings

圖2 土沉香根部罹病壞死Fig.2 Necrosis of the susceptible Aquilaria sinensis root

圖3 土沉香病原根結(jié)線蟲感染的番茄幼苗Fig.3 Tomato seedlings infected by root-knot nematodes collected from Aquilaria sinensis seedlings

2.2 形態(tài)學(xué)特征

雌蟲:乳白色,呈梨形,頸明顯突出,頭區(qū)無環(huán)紋,唇盤圓盤狀,略突起,口針細長,基部球粗大,椎體部與桿部等長。

2齡幼蟲:蠕蟲形,體環(huán)清晰,頭區(qū)略縊縮,口針細長,基部球大而圓,體部與桿部分界明顯,尾部透明區(qū)明顯,尾尖鈍圓。

會陰花紋:為近圓的六邊形至卵圓形,線紋較緊密,呈波浪形,連續(xù)或間斷,背弓較高,側(cè)線不明顯,尾端區(qū)通常有刻點。

表1 土沉香象耳豆根結(jié)線蟲雌蟲和2齡幼蟲的測量值1)

Table 1 Measurement of female and second-stage juvenile ofMeloidogyneenterolobiionAquilariasinensis

蟲態(tài)Stage體長/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針/μmStyletDEGO/μm尾長/μmTaillength雌蟲Female(n=20)764.3(637.6～823.5)635.2(512.6～756.3)15.7(14.3～17.5)5.2(4.4～6.0)-2齡幼蟲Second-stagejuvenile(n=20)458.3(427.8～484.1)15.4(14.3～16.7)12.4(11.2～13.6)4.3(3.1～5.1)53.5(44.3～57.6)

2.3 分子生物學(xué)特征

利用通用引物V5367和26S對樣品HN150805的rDNA-ITS區(qū)域進行擴增,得到約750 bp的片段,經(jīng)雙向測序及拼接得到694 bp,通過BLAST比對分析,發(fā)現(xiàn)該序列(NCBI序列號為KU321697)與象耳豆根結(jié)線蟲(KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369)完全相同。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示樣品HN150805,與象耳豆根結(jié)線蟲位于同一分支,支持率為100%。

圖5 根結(jié)線蟲不同種群ITS序列的聚類分析(NJ)Fig.5 NJ tree of 16 Meloidogyne isolates based on ITS sequences of Meloidogyne enterolobii

3 結(jié)論與討論

本研究對海南省澄邁縣土沉香主要育苗基地的土沉香苗木感染根結(jié)線蟲病的情況進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)的土沉香苗圃均受到根結(jié)線蟲不同程度的危害,試驗對土沉香苗木患根結(jié)線蟲病的癥狀作了較為詳細的描述,對土沉香苗木根結(jié)線蟲病的診斷與防治有一定的指導(dǎo)意義。在此基礎(chǔ)上本研究運用形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNA-ITS序列分析的方法,將采自澄邁縣罹病土沉香苗木上的線蟲鑒定為象耳豆根結(jié)線蟲,為該病原線蟲的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1994年吳影梅等[10]認為廣東、海南兩省的白木香病原根結(jié)線蟲有南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲兩種;2011年,許天委等[11]認為海南省白木香受到南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲等3種病原線蟲的危害。均認為海南省的土沉香根結(jié)線蟲是復(fù)合侵染型,而本研究僅鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲1種病原。我們認為這樣的結(jié)果并不矛盾,本試驗在之前形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合了分子生物學(xué)特征的分析,試驗結(jié)果具有更高的準確性;且有報道稱象耳豆根結(jié)線蟲已成為海南省蔬菜作物上一個主要的根結(jié)線蟲病原種,在海南全島普遍發(fā)生[12-13]。本試驗之所以只鑒定出1個病原種,可能是因為象耳豆根結(jié)線蟲已成為該地區(qū)土沉香的優(yōu)勢病原根結(jié)線蟲,在挑取卵塊于番茄上純化分離時,挑取的恰好是象耳豆根結(jié)線蟲卵塊。在此基礎(chǔ)上,我們已開展了土沉香病原根結(jié)線蟲種群結(jié)構(gòu)分析研究與生物防治研究。

象耳豆根結(jié)線蟲于1983年由Yang和Eisenback[14]在中國海南島的青皮象耳豆樹Enterolobiumcontortisiliquum(Vell.) Morong根部首次發(fā)現(xiàn)并描述,定名為M.enterolobii;Rammah和Hirschmann[15]于1988年在波多黎各島從一種茄子SolanummelongenaL.上分離并描述,定名為M.mayaguensis。2004年,Brito等[16]在佛羅里達州分離的4個M.mayaguensis隔離種群的形態(tài)特征與1983年Yang & Eisenback 描述的象耳豆根結(jié)線蟲一致。2012年,Karssen 和Liao[17]對Rammah和Hirschmann 描述的M.mayaguensis與Yang 和Eisenback描述的M.enterolobii的雌蟲、雄蟲、2齡幼蟲的形態(tài)特征進行了全面、詳細的比較,揭示了這兩個原種描述上的差異,并最終確定此二者為同物異名,M.mayaguensis是次異名,統(tǒng)一使用M.enterolobii作為象耳豆根結(jié)線蟲的拉丁文名。

象耳豆根結(jié)線蟲作為一種多寄主的病原根結(jié)線蟲,具有強致病力而且還能克服線蟲Mi抗性基因[18],對農(nóng)作物造成毀滅性的危害。自1983首次在青皮象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)以后,其寄主范圍與發(fā)生地區(qū)以極快的速度不斷擴大[19-22],尤其在福建[23]、海南和廣東[13,24]等熱帶、亞熱帶地區(qū),該線蟲無越冬現(xiàn)象,常年危害作物,已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的根結(jié)線蟲之一。歐洲和地中海植物保護組織發(fā)布的資料顯示[25],除中國以外,四大洲的亞熱帶地區(qū)也有象耳豆根結(jié)線蟲發(fā)生,且其寄主包括大豆、咖啡、棉花、煙草等在內(nèi)的許多世界性農(nóng)作物與經(jīng)濟作物,EPPO已將其列為檢疫性線蟲。

本研究詳細闡述了土沉香根結(jié)線蟲病的發(fā)生癥狀,對生產(chǎn)實踐中土沉香根結(jié)線蟲病的識別與診斷有一定的參考價值。同時首次確認了海南省澄邁地區(qū)土沉香的病原根結(jié)線蟲是象耳豆根結(jié)線蟲,為土沉香根結(jié)線蟲病的進一步研究與防治提供了新的依據(jù)。鑒于土沉香根結(jié)線蟲病的嚴重危害性,在明確其病原的基礎(chǔ)上,高效無公害的治療措施以及可持續(xù)的控制方法研究將是未來防治土沉香根結(jié)線蟲病乃至象耳豆根結(jié)線蟲的關(guān)鍵。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(Ⅰ)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:128-129.

[2] 國家環(huán)境保護局, 中國科學(xué)院植物研究所.中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)[M].北京:科學(xué)出版社, 1987.

[3] 國家重點保護野生植物名錄(第一批)[J].植物雜志,1999(5):4-11.

[4] 王亞沉, 王玉英, 肖楚楚, 等. 珍貴樹種沉香繁育技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化[J]. 現(xiàn)代園藝, 2015(17): 60-62.

[5] 毛琦. 陜西省溫室蔬菜根結(jié)線蟲的種類鑒定[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[6] 王曦茁, 汪來發(fā), 楊佐忠, 等. 四川省茂縣花椒根結(jié)線蟲病病原鑒定[J]. 植物保護, 2014, 40(4): 84-88.

[7] 張紹升. 植物線蟲病害診斷與治理[M]. 福州: 福建科技出版社, 1999.

[8] 章淑玲,林谷園,張學(xué)才. 蓮霧根結(jié)線蟲種類鑒定研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2014(11):69-71.

[9] Shi Jingying, Liu Aiyuan, Li Xueping, et al.Control ofPhytophthoranicotianaedisease, induction of defense responses and genes expression of papaya fruits treated withPseudomonasputidaMGP1 [J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(3): 568-574.

[10]吳影梅, 陸安娜. 南藥根結(jié)線蟲病[J]. 中藥材, 1994(6): 5-8.

[11]許天委, 林春光, 郝慧華, 等. 海南省白木香根結(jié)線蟲的為害性調(diào)查與初步鑒定[J]. 中國植保導(dǎo)刊, 2011, 31(12): 30-32.

[12]符美英, 曾向萍, 芮凱, 等. 海南島南藥根結(jié)線蟲種類鑒定[J]. 植物保護, 2015, 41(4): 171-175.

[13]龍海波, 孫艷芳, 白成, 等. 海南省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定研究[J].熱帶作物學(xué)報, 2015, 36(2): 371-376.

[14]Yang Baojun, Eisenback J.Meloidogyneenterolobiin. sp. (Meloidogynidae), a root-knot nematode parasitizing pacara earpod tree in China [J].Journal of Nematology,1983,15(3):381-391.

[15]Rammah A, Hirschmann H.Meloidogynemayaguensisn. sp. (Meloidogynidae), a root-knot nematode from Puerto Rico [J]. Journal of Nematology, 1988, 20(1): 58-69.

[16]Brito J A, Powers T O, Mullin P G, et al. Morphological and molecular characterization ofMeloidogynemayaguensisisolates from Florida[J]. Journal of Nematology,2004, 36(3):232-240.

[17]Karssen G, Liao Jinling, Zhuo Kan, et al. On the species status of the root-knot nematodeMeloidogynemayaguensisRammah & Hirschmann, 1988 [J]. ZooKeys, 2012, 181: 67-77.

[18]Kiewnick S, Dessimoz M,Franck L. Effects of the Mi-1 and the N root-knot nematode resistance gene on infection and reproduction ofMeloidogyneenterolobiion tomato and pepper cultivars [J]. Journal of Nematology, 2009,41:134-139.

[19]Long H B, Bai C, Peng J, et al. First report of the root-knot nematodeMeloidogyneenterolobiiinfecting jujube in China [J]. Plant Disease, 2014, 98(10): 1451.

[20]Gao B, Wang R Y, Chen S L, et al. First report of root-knot nematodeMeloidogyneenterolobiion sweet potato in China [J]. Plant Disease, 2014, 98(5): 702.

[21]Wang Y F, Xiao S, Huang Y K.et al. First report ofMeloidogyneenterolobiion carrot in China [J]. Plant Disease, 2014, 98(7): 1019.

[22]王劍, 宋志強, 成飛雪, 等. 湖南省辣椒上首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲[J]. 植物保護, 2015, 41(4): 180-183.

[23]楊意伯. 福建龍眼、荔枝、番石榴線蟲病害調(diào)查及寄生線蟲種類鑒定[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué), 2013.

[24]卓侃, 胡茂秀, 廖金鈴, 等. 廣東省和海南省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,27(2):193-197.

[25]European and Mediterranean Plant Protection Organization.Meloidogyneenterolobii[J]. EPPO Bulletin, 2014, 44(2):159-163.

(責任編輯：楊明麗)

Identification of root-knot nematodeMeloidogyneenterolobiifromAquilariasinensisin Hainan Province

Su Shengsong, Zhou Guoying, Li He, Wang Jiao, He Yuanhao, Liu Jun’ang

(KeyLaboratoryforNon-woodForestCultivationandConservationofMinistryofEducation,HunanProvincialKeyLaboratoryforControlofForestDiseasesandPests,CollegeofForestry,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China)

The nematode species onAquilariasinensisin Chengmai County, Hainan Province was identified by morphological observation and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the root-knot nematode occurred commonly onA.sinensiswasMeloidogyneenterolobiiYang & Eisenback. This is the first report ofM.enterolobiionA.sinensisin Hainan Province, which will be helpful to control the root-knot nematode ofA.sinensis.

Aquilariasinensis;Meloidogyneenterolobii; rDNA-ITS

2016-09-05

2016-09-21

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304402)

S 435.671

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.033

* 通信作者 E-mail:gyzhou2118@163.com