化麗丹, 蔣杰賢, 季香云*, 萬(wàn)年峰, 張 浩, 楊益眾

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所, 上海 201403; 2. 江蘇省泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局, 泰州 225300; 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009)

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蓖麻提取液對(duì)甜菜夜蛾幼蟲解毒酶活性的影響

化麗丹1,2, 蔣杰賢1, 季香云1*, 萬(wàn)年峰1, 張 浩1, 楊益眾3

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所, 上海 201403; 2. 江蘇省泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局, 泰州 225300; 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009)

為探討植物提取液對(duì)甜菜夜蛾解毒酶系活性的影響效應(yīng),采用浸漬法測(cè)定了不同濃度蓖麻堿 (3.80、1.90、0.95、0.48和0.24 g/L)對(duì)甜菜夜蛾幼蟲堿性磷酸酯酶(AKP)、酸性磷酸酯酶(ACP)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響。結(jié)果表明：與清水對(duì)照組相比,不同濃度處理48 h和72 h對(duì)AKP的抑制作用均達(dá)到顯著水平,而3.80 g/L處理24 h即可顯著抑制AKP活性;與對(duì)照組相比,不同濃度蓖麻堿處理72 h均會(huì)顯著降低其ACP活性,而濃度大于0.24 g/L時(shí)處理24 h和48 h即可顯著降低 ACP活性;蓖麻堿處理組GSTs活性在處理后24、48和72 h都顯著低于對(duì)照組,但不同濃度間無(wú)顯著差異;本研究揭示了蓖麻堿對(duì)這3種解毒酶均有較強(qiáng)的抑制作用,且抑制作用隨蓖麻堿濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

蓖麻堿; 甜菜夜蛾; 幼蟲; 解毒酶; 抑制作用

蓖麻Ricinuscommunis屬大戟科蓖麻屬植物,具有較強(qiáng)的殺蟲、殺菌作用,是制造生物農(nóng)藥的重要來(lái)源[1-3]。蓖麻堿是蓖麻的主要毒素之一,具有較強(qiáng)的殺蟲活性,其對(duì)蚜蟲[4]、菜青蟲[5]、甜菜夜蛾[6]、小菜蛾[7]和金龜甲[8]等害蟲的殺蟲作用已有報(bào)道。甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)屬鱗翅目夜蛾科害蟲,主要為害大豆、棉花、玉米、十字花科蔬菜和茄科植物[9],利用蓖麻堿防治甜菜夜蛾的作用機(jī)制的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

蓖麻堿作用于昆蟲的組織和器官,影響其解毒酶活性。酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(AKP)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSH-S)是昆蟲體內(nèi)重要的解毒代謝酶,在殺蟲劑及植物次生物質(zhì)代謝中具有重要的作用[10-12]。本研究以甜菜夜蛾為對(duì)象,從生化水平探討蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶的影響,以期為進(jìn)一步揭示蓖麻堿殺蟲機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲源

甜菜夜蛾卵塊采自上海市奉賢區(qū)青村農(nóng)業(yè)合作社的甘藍(lán)地,在人工氣候箱(28±1℃、L∥D=14 h∥10 h、RH=80%±5%)中用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)7～9代。在培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)甜菜夜蛾化蛹后,將蛹放置到羽化籠中。等成蟲羽化后,用10%的蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),雌、雄甜菜夜蛾成蟲交配產(chǎn)卵后,將卵塊孵化后的幼蟲飼養(yǎng)至2齡末用于試驗(yàn)。

1.1.2 供試藥劑

蓖麻堿由華東理工大學(xué)分析與測(cè)試中心從蓖麻餅粕中提取、分離并純化,其有效成分含量≥99.8%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試蟲處理方法

參照Ismail和Wright[13-14]的葉片藥劑浸漬法。取新鮮干凈的甘藍(lán)葉片,在不同濃度(3.80、1.90、0.95、0.48、0.24 g/L)的蓖麻堿溶液中分別浸漬10 s,室內(nèi)自然晾干,放置于直徑為12 cm的潔凈培養(yǎng)皿中,將中性濾紙鋪于培養(yǎng)皿底部,每個(gè)培養(yǎng)皿接入大小一致的甜菜夜蛾2齡末幼蟲50頭,以清水作對(duì)照,每個(gè)處理和對(duì)照重復(fù)3次。分別于24、48、72 h后收集活蟲供酶源制備。

1.2.2 酶源的制備

取供試幼蟲置于玻璃勻漿器中,按3齡10頭/mL,4齡4頭/mL(緩沖溶液大致為試蟲體重9倍),加入預(yù)冷緩沖液,其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的制備用0.04 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液;酸性磷酸酯酶(ACP)的制備用0.2 mol/L pH 4.6醋酸緩沖液;堿性磷酸酯酶(AKP)的制備用0.05 mol/L pH 10.0 碳酸鈉緩沖液,冰浴下勻漿,勻漿液倒入離心管內(nèi),4℃下8 000 r/min離心10 min,上清液即為酶液,置于-20℃冰箱待用[15-17]。

1.2.3 酶活性測(cè)定[10]

1.2.3.1 酸性磷酸酯酶(ACP)和堿性磷酸酯酶(AKP)活性測(cè)定

酸性和堿性磷酸酯酶分解磷酸苯二鈉,產(chǎn)生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用,經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據(jù)紅色深淺測(cè)定酶活性的高低[18]。試驗(yàn)采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行。在37℃條件下,以每克甜菜夜蛾幼蟲組織勻漿與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個(gè)酶活力單位,每個(gè)處理重復(fù)3次。

酸性磷酸酶(ACP)計(jì)算公式：

酸性磷酸酶活性(U/g)=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量(0.003 mg)/所加樣本的蛋白克數(shù)；

堿性磷酸酶(AKP)計(jì)算公式：

堿性磷酸酶活性(U/g)=(測(cè)定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.1 mg/mL)/待測(cè)樣本蛋白濃度(g/mL)。

1.2.3.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性測(cè)定

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶具有催化還原型谷胱甘肽與1-氯-2,4-二硝基苯結(jié)合的能力,在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi),其活性高低與反應(yīng)前后底物濃度的變化呈線性關(guān)系。通過(guò)谷胱甘肽濃度的高低來(lái)反映谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的大小,谷胱甘肽濃度降低越多,則谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性越大,反之則小?；钚詼y(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行。以每克甜菜夜蛾組織勻漿在37℃反應(yīng)1 min后,扣除非酶促反應(yīng),使反應(yīng)體系中GSH濃度降低為1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位。每個(gè)處理重復(fù)3次。谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶計(jì)算公式：

組織中的GST活力(U/mg)=

(對(duì)照管OD值-測(cè)定管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-

空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度×稀釋倍數(shù)/

反應(yīng)時(shí)間/(取樣量×蛋白濃度)。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2007整理后,用SPSS16.0軟件,用Tukey’sHSD多重比較法比較不同濃度蓖麻提取液處理的甜菜夜蛾在處理后不同時(shí)間內(nèi)解毒酶活性在5%水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶活性的影響

由表1可知,蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶具有較強(qiáng)的抑制作用,且蓖麻堿濃度越高,其對(duì)堿性磷酸酯酶的抑制作用越強(qiáng)。蓖麻堿作用于甜菜夜蛾時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶抑制作用也越強(qiáng)。蓖麻堿濃度低于1.90g/L時(shí),其處理24h對(duì)幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶的抑制作用不顯著,但5種濃度處理48h和72h對(duì)幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶的抑制作用均達(dá)到顯著水平。

表1 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶活性的影響1)

Table 1 Effect of ricinine on the activity of AKP inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration堿性磷酸酯酶活性/U·g-1 Activityofalkalinephosphatase24h48h72h3.80(0.135±0.027)bA(0.039±0.008)bB(0.003±0.0062)cC1.90(0.141±0.057)abA(0.044±0.022)bB(0.003±0.0010)bcC0.95(0.142±0.043)abA(0.046±0.014)bB(0.004±0.0020)bC0.48(0.156±0.024)aA(0.050±0.019)bB(0.005±0.0033)bC0.24(0.160±0.018)aA(0.054±0.021)bB(0.006±0.0024)bC0(CK)(0.174±0.012)aA(0.155±0.040)aA(0.159±0.0030)aA

1) 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤;同列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著,同行數(shù)據(jù)不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。 The data were presented as mean±SE. The data in same column followed with different lowercase letters were significantly different, and the data in same row followed with different capital letters were significantly different (Tukey’s HSD test,P<0.05),The same apllies below.

2.2 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)酸性磷酸酯酶活性的影響

由表2可知,蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)酸性磷酸酯酶具有較強(qiáng)的抑制作用,且這種抑制作用隨蓖麻堿濃度升高和蓖麻堿作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。與清水對(duì)照組相比,不同濃度蓖麻堿處理24 h和48 h,除0.24 g/L蓖麻堿對(duì)酸性磷酸酯酶的抑制作用不顯著外,其他4種濃度處理均對(duì)酸性磷酸酯酶的活性有顯著抑制作用;5種蓖麻堿濃度處理72 h對(duì)幼蟲體內(nèi)的酸性磷酸酯酶的抑制作用都達(dá)到顯著水平。

表2 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)酸性磷酸酯酶活性的影響

Table 2 Effect of ricinine on the activity of ACP inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration酸性磷酸酯酶活性/×102U·g-1 Activityofacidphosphatase24h48h72h3.80(0.302±0.001)cA(0.200±0.010)cB(0.025±0.001)cC1.90(0.402±0.002)cA(0.220±0.001)cB(0.031±0.001)cC0.95(0.535±0.002)bcA(0.430±0.001)bA(0.041±0.001)cB0.48(0.620±0.001)bA(0.450±0.004)bA(0.054±0.003)cB0.24(0.930±0.001)aA(0.840±0.001)aA(0.067±0.001)bB0(CK)(0.970±0.002)aA(0.920±0.001)aA(0.860±0.001)aA

2.3 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

由表3可知,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性隨蓖麻堿濃度增大而降低,不同濃度蓖麻堿處理24、48和72 h,甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性均顯著低于對(duì)照。相同濃度處理下,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)蓖麻堿對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的抑制作用也增強(qiáng),表現(xiàn)為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性降低。但5種蓖麻堿濃度處理無(wú)顯著差異。

表3 蓖麻堿對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

Table 3 Effect of ricinine on the activity of GSTs inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性/U·g-1 ActivityofglutathioneS-transferase24h48h72h3.80(1.970±0.188)bA(0.855±0.144)bB(0.365±0.234)bC1.90(1.990±0.361)bA(0.991±0.098)bB(0.620±0.054)bC0.95(2.074±0.106)bA(1.050±0.332)bB(1.140±0.216)bB0.48(2.454±0.120)bA(1.201±0.106)bB(1.170±0.083)bB0.24(2.977±0.335)bA(1.495±0.156)bB(1.190±0.159)bC0(CK)(18.580±0.181)aA(17.820±0.045)aA(19.550±0.285)aA

3 小結(jié)與討論

昆蟲解毒酶系的誘導(dǎo)作用是對(duì)內(nèi)源和外源有毒物質(zhì)的一種適應(yīng)。各種外源化合物誘導(dǎo)昆蟲的解毒酶系活性,這保證了昆蟲在受到化學(xué)環(huán)境壓力作用下迅速作出反應(yīng),從而存活下來(lái)。昆蟲體內(nèi)解毒酶主要包括各種酯酶(羧酸酯酶、磷酸酯酶等)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶及微粒體多功能氧化酶系[20]。

昆蟲體內(nèi)解毒酶系活性的變化,是昆蟲對(duì)化學(xué)藥劑敏感性產(chǎn)生變化的重要原因之一,也是衡量植物抗蟲性的重要指標(biāo)之一[21]。研究表明,殺蟲劑經(jīng)過(guò)滲透、運(yùn)輸、分配到達(dá)昆蟲體內(nèi)后,一部分被體內(nèi)解毒酶轉(zhuǎn)化分解,另一部分到達(dá)作用位點(diǎn)殺滅害蟲[22]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、磷酸酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系,在對(duì)外源化合物的解毒代謝和對(duì)殺蟲劑的抗性機(jī)制中起著重要的作用[23],解毒酶的活性變化可能改變其對(duì)殺蟲劑的敏感型[24]。

劉進(jìn)進(jìn)等[3]研究報(bào)道,蓖麻堿藥液對(duì)甜菜夜蛾具有優(yōu)良的毒殺效果,其死亡率與施藥時(shí)間呈正相關(guān);謝宏峰等[25]發(fā)現(xiàn)蓖麻葉片粗提物對(duì)甜菜夜蛾幼蟲在一定濃度范圍內(nèi)具有一定的拒食作用,濃度越大拒食作用越強(qiáng);并且對(duì)甜菜夜蛾幼蟲還具有一定胃毒作用，毒殺作用隨著粗提物濃度提高而加強(qiáng)。萬(wàn)年峰等[4]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸和蓖麻提取液亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖有一定的抑制作用,且亞致死劑量濃度越大,對(duì)甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖影響越大。而在本研究中,甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和磷酸酯酶活性隨蓖麻堿作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降,這可能是造成甜菜夜蛾在藥劑處理后死亡的主要原因。同時(shí),蓖麻堿作用24 h對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酯酶的抑制作用不顯著,但作用48 h和72 h對(duì)其抑制作用非常顯著,這可能是因蓖麻堿到達(dá)蟲體后,部分被幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶轉(zhuǎn)化分解,但隨著蓖麻堿作用時(shí)間延長(zhǎng),幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶減少,而大部分蓖麻堿可以到達(dá)作用位點(diǎn),對(duì)蟲體起到較強(qiáng)的毒殺作用,這也解釋了某些殺蟲劑對(duì)昆蟲的毒殺作用與其對(duì)昆蟲的作用時(shí)間呈正比的原因。不同解毒酶分解轉(zhuǎn)化有毒物質(zhì)的能力有一定差別[24,26];甜菜夜蛾經(jīng)5種濃度蓖麻堿處理后,其谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性都受到顯著抑制,而較高濃度處理后其堿性磷酸酯酶活性才受到顯著抑制。蓖麻堿處理后甜菜夜蛾體內(nèi)解毒酶活性的變化,在一定程度上驗(yàn)證了不同濃度的蓖麻堿藥液處理甜菜夜蛾后,隨著藥液濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)甜菜夜蛾的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖影響增大,在達(dá)到致死濃度劑量時(shí),其死亡率隨著藥液濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng),死亡率升高。

蓖麻堿濃度對(duì)解毒酶活性的影響較大,且其濃度越大對(duì)解毒酶活性的抑制能力越強(qiáng)。與清水對(duì)照組相比,0.24和0.48 g/L兩種濃度處理24 h對(duì)甜菜夜蛾堿性磷酸酯酶活性無(wú)顯著影響,但高于這兩種濃度處理24 h后顯著抑制其堿性磷酸酯酶活性。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Effect of ricinine on the activities of detoxifying enzymes inSpodopteraexigualarvae

Hua Lidan1,2, Jiang Jiexian1, Ji Xiangyun1, Wan Nianfeng1, Zhang Hao1, Yang Yizhong3

(1.InstituteofEco-EnvironmentProtection,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China; 2.TaizhouEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Taizhou225300,China; 3.CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

To investigate the effect of plant extracts on the detoxifying enzymes of noctuid, we used the dipping method to determine the effects of the five different concentrations of ricinine (3.80、1.90、0.95、0.48 and 0.24 g/L) on alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP) and glutathioneS-transferase (GSTs). The results indicated that compared to the control group (fresh water treatment), the treatment of ricinine significantly inhibited the activities of AKP at 48 and 72 h after; while the treatment of 3.80 g/L of ricinine could inhibit the activity of AKP at 24 h post treatment. The activities of ACP were also significantly inhibited in all five ricinine-treated groups at 72 h after treatment, while the treatments with concentrations higher than 0.24 g/L significantly inhibited the activity of ACP at 24 and 48 h after treatment. The activities of GSTs were all significantly inhibited in all treatments compared to that of the control, but no difference was found among treatments of different concentrations. These results indicated that ricinine had a strong inhibitory effect on the three enzymes tested and the inhibition were concentration- and time-dependent.

ricinine;Spodopteraexigua; larvae; detoxifying enzymes; inhibition effect

2016-11-29

2017-02-21

上海市科技興農(nóng)推廣項(xiàng)目[滬農(nóng)科推字(2016)第2-2-8號(hào)];上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2016)第3-4-2號(hào)]

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.015

* 通信作者 E-mail：hwfy2002@163.com