朱慶賀，苗艷，王爽，陳曦，王觀悅，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，齊齊哈爾 161006)

?

高效液相色譜法測定利福昔明混懸乳劑的含量

朱慶賀，苗艷，王爽，陳曦，王觀悅，史同瑞*

(黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，齊齊哈爾 161006)

建立了測定利福昔明混懸乳劑含量的高效液相色譜法(HPLC)。采用C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇-乙腈-0.075 mol/L磷酸二氫鉀溶液-1 mol/L檸檬酸溶液(32∶28∶25∶4)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長236 nm，進樣量20 μL，柱溫25 ℃。利福昔明濃度在5～100 μg/mL時，其峰面積與濃度線性關系良好(r2=0.9996)，無雜質干擾，穩(wěn)定性高，回收率范圍為98.4%～100.2%，RSD為0.58%～1.32%。本操作方法簡便、分析快速、結果準確，適用于利福昔明混懸乳劑的含量測定。

利福昔明；混懸乳劑；高效液相色譜法；含量

利福昔明是利福霉素衍生物，是一種高效低毒的腸道抗生素。適用于革蘭氏陽性菌及陰性菌、需氧及厭氧細菌所致急慢性腸道感染等癥。在人類醫(yī)學領域，利福昔明主要用于治療腸道感染、腹瀉、小腸結腸炎等病癥[1-2]。但是，近年來獸醫(yī)領域也有相關應用的報道，其藥物劑型主要有干混懸劑、噴霧劑和混懸液[3-4]。而本實驗室成功研制了利福昔明混懸乳劑，具備穩(wěn)定性好，生物相容性好，緩釋效果顯著的特點，為利福昔明的獸醫(yī)臨床應用提供了一種新的藥物劑型，首次建立了針對此劑型的HPLC含量測定法。該測定方法能夠為利福昔明混懸乳劑劑型的開發(fā)提供一定的參考價值，對于該劑型的穩(wěn)定性研究、藥代動力學研究以及進一步的臨床試驗都具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料 利福昔明對照品，含量95.7%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；利福昔明混懸乳劑(自制)，規(guī)格為：2%利福昔明混懸乳劑；乙腈/甲醇均為色譜純，賽默飛世爾科技公司 ；磷酸二氫鉀/檸檬酸，天津天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器 電子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司； InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；高效液相色譜儀，LC-20AT SPD-20A，SHIMADZU；純水儀，XYE2-20-H型，北京湘順源科技有限公司；實驗室PH計，F(xiàn)E20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；注溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長236 nm；進樣量20 μL；流動相：甲醇-乙腈-0.075 mol/L磷酸二氫鉀溶液-1 mol/L檸檬酸溶液(32∶28∶25∶4)。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的利福昔明對照品(p=95.7%)10 mg，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg/mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為20 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取樣品適量(相當于利福昔明20 mg)，置100 mL 容量瓶中，加流動相充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液1 mL置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按配方比例量取與供試品相當?shù)目瞻兹閯?與利福昔明混懸乳劑相比只是不含利福昔明，其他成分相同)適量，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗 分別量取利福昔明對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按2.1項色譜條件測定，結果見圖1。在該色譜條件下，利福昔明的保留時間k為6.9 min左右，陰性對照在此時間附近沒有出峰，因此對利福昔明HPLC的測定沒有影響，專屬性能滿足檢測要求。

圖1 HPLC圖譜Fig 1 The HPLC chromatogram

2.4 線性試驗 精密量取對照品儲備液0.5、2.0、4.0、8.0、10 mL分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為5、20、40、80、100 μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件測定，以峰面積(y)對利福昔明的濃度(x，μg/mL)進行線性回歸方程，方程為y=65047x+48715，r2=0.9996。結果表明利福昔明在5～100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 回收率測定 取2.2.1項制備的100 μg/mL儲備液，分別精密取適量儲備液并添加配方劑量的空白懸浮乳劑基質，超聲溶解后，用流動相稀釋成低(L=10 μg/mL )、中(M=50 μg/mL)、高(H=80 μg/mL)3種理論濃度的對照品，每個濃度配制3份，按2.1項下色譜條件測定其含量，計算回收率，結果見表1。結果表明高、中、低濃度對照品的回收率范圍為98.4%～100.2%，RSD為0.58%～1.32%。該方法回收率符合要求。

圖2 利福昔明標準曲線Fig 2 The standard curve of rifaximin

表1 利福昔明的回收率Tab 1 Recovery rate of Rifaximin

回收率R%=實測濃度/理論濃度×100%

2.6 精密度試驗 取2.2.1項制備的100 μg/mL儲備液，精密取適量儲備液，用流動相稀釋成20 μg/mL的標準溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，分別測定其峰面積。結果表明RSD為0.97%，精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取2.2.1項制備的100 μg/mL儲備液，精密取適量儲備液，用流動相稀釋成20 μg/mL的標準溶液，按2.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測定其峰面積。結果表明平均峰面積為1298966，RSD為1.05%。表明本品在12 h內含量穩(wěn)定。

2.8 樣品含量測定 精密量取3批次的利福昔明混懸乳劑樣品，每批次3份，按2.2.2項制成供試品溶液，進行含量測定。結果表明，批號為20141201、20160315、20161031的3批樣品中利福昔明平均含量分別為標示量的96.22%、99.39%、101.22%，符合規(guī)定。

3 討論與小結

3.1 測定波長和色譜柱的選擇 根據(jù)文獻報道[5-6]，利福昔明在240 nm附近有較大吸收。因此初選240、254、236 nm波長下測定利福昔明混懸乳劑中利福昔明的含量。通過色譜結果的比較分析，在236 nm波長下測定，能夠獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，本試驗中選擇236 nm作為利福昔明含量的檢測波長。

色譜柱中C8和C18都是反相色譜柱的一種，適用于分析弱極性的物質，C8在弱極性較強的一側，C18在極性較弱的一側，但是差別并不是十分明顯，在加上C18較C8具有更好的保留特性，本試驗參考相關文獻[7]方法選擇了C18色譜柱。試驗證明，利用C18色譜柱進行色譜分析分離度好，適用于利福昔明混懸乳劑含量的測定。

3.2 利福昔明混懸乳劑 利福昔明是人工半合成抗菌藥[2]，具有廣譜殺菌作用，對革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌，以及革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、巴氏桿菌均具有良好的殺滅效果，而這些細菌恰恰又是引起奶牛乳房炎發(fā)生的主要病原微生物。另一方面，利福昔明的藥代動力學研究表明，利福昔明在口服后基本無系統(tǒng)吸收，只在局部發(fā)揮高效的抗菌作用。綜上所述，利福昔明可以作為一種良好的奶牛乳房局部作用型抗菌藥物。郭旭[8]等利用制備的利福昔明乳房注入劑對干奶期奶牛臨床型乳房炎的預防效果進行了觀察。結果表明，利福昔明高劑量組對干奶期奶牛臨床型乳房炎的預防效果與空白對照組相比，差異極顯著(P<0.01)，說明利福昔明對臨床型乳房炎有較好的預防效果。

本實驗室成功研制了利福昔明混懸乳劑，兼具了利福昔明和混懸乳劑的共同優(yōu)點，是奶牛乳房炎防治的一種創(chuàng)新劑型。建立了利福昔明混懸乳劑中利福昔明的HPLC的檢測方法，本方法分離度好，利福昔明的保留時間在6.9 min左右，峰形好，基本無拖尾，雜質不干擾試驗測定，而且采用外標法測定利福昔明混懸乳劑的含量操作簡單，結果準確，回收率高，重現(xiàn)性好，是利福昔明懸浮乳劑中利福昔明含量測定的簡便、快速、準確的方法。

[1] Steffen R, Sack D A, Riopel I,etal. Therapy of travelers diarrhea with rifaximin on various continents[J]. American Journal of Gastroenterology. 2003, 98: 1073-1078.

[2] Infante R M, Ericsson C D, Jiang Z D,etal. Eleroaggragative scherichia coli diarrhea intraverlers: response to rifaximin therapy[J]. Cli Gastroenterol Hepatol. 2004, 2(2): 135-138.

[3] 李晶. 利福昔明陰道栓和緩釋陰道泡騰片的研制及評價[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2011.

LI J. Research and development on the rifaximin baginal suppository and rifaximin sustained-release baginal effervescent tablets[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2011.

[4] 尚士光. HPLC法測定利福昔明干混懸劑中利福昔明的含量[J]. 中國醫(yī)藥導報，2008,5(35)：27-28.

SHANG S G. Determination of rifaximin in Rifaximin Dry Suspension by HPLC[J].China medical herald, 2008,5(35)：27-28.

[5] 申蘭慧，石濤，趙春才，等.利福昔明片的高效液相色譜分析[J]. 江蘇藥學與臨床研究，2003,11(5)：28-30.

SHEN L H, SHI T,ZHAO C C,etal.Determination of Rafaximin and Impurities in Rafaximin Tablets by HPLC[J]. Jiangsu Pharmacertical and Clinical Research，2003,11(5)：28-30.

[6] 潘麗，廖慧瓊，蘇健強，等.利福昔明干混懸劑溶出度測定方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013,9(8)：44-45.

PAN L, LIAO H Q,SU J Q,etal.Research on Dissolution Test Method of Rifaximin Dry Suspension[J].Asia-Pacfic Traditional Medicine, 2013,9(8)：44-45.

[7] 張祖兵.利福昔明的結構確證和質量標準研究[D].成都：四川大學，2004.

ZHANG Z B.Study on the structure and quality criterion of rifaximin[D]. Chendu: Sichuan University, 2004.

[8] 郭旭，李培鋒，關紅，等.利福昔明乳房注入劑對干奶期奶牛臨床型乳房炎預防效果觀察[J].動物醫(yī)學進展.2013,34(7)：115-120.

GUO X, LI P F, GUAN H,etal.Observation of Rifaximin Intramammary Infusion on Prophylactic Efficacy of Clinical Mastitis in Dairy Cow of Dry Period[J].Progress in Veterinary Medicine.2013,34(7)：115-120.

(編輯：陳希)

Content Determination of Rifaximin Suspo-emulsions by HPLC

ZHU Qing-he, MIAO Yan, WANG Shuang, CHEN Xi, WANG Guan-yue, SHI Tong-rui*

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryScience,Qiqihar161006,China)

SHITong-rui,E-mail:systr@sina.com

A method for the content determination of rifaximin suspoemulsion by HPLC was established. HPLC system consisted of C18 column(5 μm, 4.6 mm×150 mm), methyl alcohol-acetonitrile-citric acid-potassium phosphate monobasic(32∶28∶25∶4) as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wave length was 236 nm. The injection volume was 20 μL and column temperature was room temperature. There was no interference occurred from inpurities. The calibration curve was linear in the range of 5～100 μg/mL(r2=0.9996).The recovery was 98.4%～100.2% andRSDwas 0.58%～1.32%. The method is rapid, simple and accurate for the content determination of rifaximin suspo-emulsions.

rifaximin；suspo-emulsions ；HPLC；content

黑龍江省應用技術研究與開發(fā)項(czznkt2016-2) 作者簡介： 朱慶賀，研究實習員，碩士，從事獸藥研究。

史同瑞。E-mail: systr@sina.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.08

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 07-0042-05

S859.79