孟蕾，周紅霞，李慧素，彭麗，馬浩軒，吳寧鵬*

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州市第七中學(xué)，鄭州 450008)

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高效液相色譜法測(cè)定飼料中七種水溶性色素

孟蕾1，周紅霞1，李慧素1，彭麗1，馬浩軒2，吳寧鵬1*

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州市第七中學(xué)，鄭州 450008)

應(yīng)用高效液相色譜法建立了飼料中檸檬黃、桔黃、胭脂紅、食品紅、莧菜紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)7種水溶性色素測(cè)定的新方法。樣品經(jīng)40 mL乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)兩次提取，PWAX柱凈化處理后，以0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，7種水溶性色素經(jīng)C18柱得到良好分離。7種水溶性色素在0.5(1.0) ～ 50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999。亮藍(lán)的檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg；靛藍(lán)的檢出限為1.0 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg。飼料樣品在定量限、低、中、高4個(gè)加標(biāo)濃度下，7種水溶性色素的回收率為60.6%～116.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～7.3%，結(jié)果表明方法適用于飼料中7種水溶性色素的檢測(cè)要求。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、雜質(zhì)干擾少。

水溶性色素；飼料；高效液相色譜

近年來(lái)人工合成色素因其廉價(jià)、高效、上色效果好被廣泛應(yīng)用于食品添加劑中，這類色素包括檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)等。除了作為食品添加劑使用之外，一些不法分子為了提高飼料的色澤，將這類色素添加到飼料中以謀取不法利益。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄(2013)》中對(duì)可使用色素的種類有明確規(guī)定，允許添加到家禽的色素有β-胡蘿卜素、辣椒紅、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯、β，β-胡蘿卜素-4，4-二酮(斑蝥黃)、天然葉黃素，而常見的人工合成色素檸檬黃、日落黃、誘惑紅、胭脂紅、靛藍(lán)、食品紅、莧菜紅、亮藍(lán)僅允許添加至寵物、觀賞魚飼料中。違禁、違規(guī)色素在飼料中的添加不同于天然色素，會(huì)給消費(fèi)者的健康帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)和危害[1]。為了保障消費(fèi)者的食品安全，建立一種快速有效的同時(shí)檢測(cè)飼料中多種人工合成水溶性色素的分析方法具有重大意義。目前，有關(guān)人工合成水溶性色素檢測(cè)的報(bào)道很多，但是研究的基質(zhì)多為化妝品[2]、飲料[3-6]、肉類食品[7-8]等，關(guān)于飼料基質(zhì)中水溶性色素的報(bào)道鮮有。根據(jù)已有報(bào)道，水溶性色素的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法，薄層色譜法、電化學(xué)法、液相色譜法[5，7，9-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[4，8，11]。凈化處理主要為直接稀釋法[3-6]、聚酰胺吸附法[12-14]和固相萃取法[6，8，11，15]。本文選用PWAX弱陰離子交換柱凈化樣品，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定七種色素，方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確。

1 材料和方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器 (美國(guó)Waters公司)；分析天平(感量0.01 g)；METTLE TOLEDO XP205電子分析天平(感量0.01 mg，梅特勒-托利多儀器公司)；KQ3200E超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；N-EVAP-112氮?dú)獯蹈蓛x (美國(guó)Organomation Associates Jnc公司)。

1.2 試劑 乙酸銨(色譜純，德國(guó)Sigma公司)，乙腈(色譜純，德國(guó)Sigma公司)，丙二醇(天津、科密歐公司)，氨水(北京化工廠)，乙酸(北京化工廠)為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng) (美國(guó)Millipore公司) 制備的去離子水。檸檬黃(純度88%)、桔黃(純度90%)、食品紅(純度80%)、胭脂紅(純度70%)、莧菜紅(純度94.7%)、亮藍(lán)(純度98%)、靛藍(lán)(純度91%)，均購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、靛藍(lán)、亮藍(lán)、桔黃、食品紅標(biāo)準(zhǔn)品適量，置10 mL容量瓶中，用水稀釋定容，分別配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)不同的添加濃度用水分別將其稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，填料粒徑為5.0 μm；流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)，流動(dòng)相B為乙腈溶液。梯度洗脫，波長(zhǎng)變化和梯度洗脫條件見表1和表2；檢測(cè)波長(zhǎng)為425、500、630 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 波長(zhǎng)變化

表2 梯度洗脫條件

1.4.2 樣品前處理 稱取試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入提取液乙腈-丙二醇-水-氨水(25∶5∶19∶1)20.0 mL，渦旋混合后，震蕩10 min，水浴超聲提取10 min。10000 r/min離心10 min，移取上清液至另一50 mL離心管中。殘?jiān)性俅渭尤?0.0 mL提取液重復(fù)提取一次，合并上清液。準(zhǔn)確移取上清液10.0 mL于另一離心管中，加入20.0 mL水，用甲酸調(diào)至pH=2.0(±0.2)，混勻后，備用。

PWAX固相萃取柱依次用甲醇和水各5 mL活化，2%甲酸溶液5 mL平衡，將備用液全部過(guò)柱。依次用2%甲酸溶液、80%甲醇(1%甲酸水)溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干。10%氨化甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入水500 μL溶解殘余物，渦動(dòng)混勻，超聲10 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，供HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍及靈敏度 準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，用水稀釋，亮藍(lán)制得0.5，1.0，2.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其它色素用水稀釋成濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，由低濃度到高濃度供高效液相色譜儀測(cè)定。以色譜峰面積比率為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表3所示。

空白試樣按相同步驟處理上機(jī)測(cè)定后，以信噪比S/N>10計(jì)算得到亮藍(lán)定量限為0.5 mg/kg，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的定量限為1.0 mg/kg，靛藍(lán)的定量限為2.0 mg/kg。以信噪比S/N>3計(jì)算得到亮藍(lán)檢測(cè)限為0.25 mg/kg，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、食品紅的檢測(cè)限為0.5 mg/kg，靛藍(lán)的檢測(cè)限為1.0 mg/kg。

表3 7種水溶性色素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法的準(zhǔn)確度及精密度 結(jié)合方法的靈敏度等因素，確定方法在配合料、濃縮料中的添加濃度分別為L(zhǎng)OQ(靛藍(lán)為2 mg/kg、亮藍(lán)為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)，5，10和100 mg/kg。每個(gè)濃度做5次平行，連續(xù)測(cè)定3 d，各化合物的回收率及批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表4、表5所示，7種水溶性色素的回收率為60.6%～116.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～7.3%，本方法顯示了良好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。各色素在配合料中的空白色譜圖見圖1?？瞻着浜狭霞訕?biāo)的色譜圖見圖2。標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖3。

3 討論與小結(jié)

3.1 液相條件優(yōu)化

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用水稀釋七種水溶性色素至10 μg/mL的溶液，進(jìn)行紫外全掃描，確定每種色素的最大波長(zhǎng)。結(jié)合可見光波段雜質(zhì)干擾少和各組分靈敏度兩個(gè)因素，選擇425、500、630 nm作為七種水溶性色素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 流動(dòng)相的確定 本試驗(yàn)選擇AglientZorbax Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5 μm)作為色譜柱，參考文獻(xiàn)，有機(jī)相考察了乙腈和甲醇，水相考察了不同濃度的乙酸銨溶液[8-9](5、10、20、50 mM)，通過(guò)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)水相使用20 mM乙酸銨，pH至調(diào)至5.0時(shí)，七種水溶性色素峰型較好，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象；有機(jī)相使用乙腈時(shí)柱壓更低，因此選擇乙腈-20 mM乙酸銨(pH=5.0)作為流動(dòng)相。

表4 濃縮料基質(zhì)中7種水溶性色素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表5 配合料基質(zhì)中7種水溶性色素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

續(xù)表

3.2 樣品提取條件的優(yōu)化 參考已報(bào)道的文獻(xiàn)，提取水溶性色素使用的提取液有水[7]、乙醇：水(1∶1，V/V)[5]，乙醇∶氨水∶水(7∶2∶1，V/V/V)[2-5]，乙醇∶氨水∶水(80∶1∶19，V/V/V)[4]。首先嘗試使用純水相提取飼料，但飼料基質(zhì)中含有大量淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪，提取溶液混濁，無(wú)法凈化，因此在提取液中加入一定比例的有機(jī)相。嘗試使用了乙醇、甲醇和乙腈這三種有機(jī)試劑，并將機(jī)相比例提高至50%、60%、70%、80%，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用60%乙腈作為提取液較為理想。同時(shí)還考察了提取液酸堿性對(duì)色素提取效率的影響，結(jié)果表明在堿性條件下色素的回收率更高，分別考察了2%和5%的氨水，兩者提取效果差異不大，但2%氨水更有利于凈化步驟調(diào)節(jié)pH值，因此初步將提取液定為乙腈：水：氨水=30∶19∶1(V∶V∶V)。隨后又對(duì)配合飼料和濃縮飼料都進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)，但濃縮飼料中靛藍(lán)回收率低，考慮靛藍(lán)易溶于丙二醇，分別加入了5%和10%丙二醇溶液，結(jié)果表明10%的丙二醇有效提高了靛藍(lán)的回收率，最終提取液優(yōu)化為乙腈∶丙二醇∶水∶氨水=25∶5∶19∶1(V∶V∶V∶V)。

3.3 凈化條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)比較了弱陰離子交換柱[8,16]PWAX、C18[6]、HLB和PEP-2固相萃取柱對(duì)七種水溶性色素的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。PWAX柱、HLB柱和PEP-2柱回收率均可以，但是一方面由于提取液有機(jī)相比例較高，過(guò)HLB和PEP-2柱之前需稀釋或濃縮提取液來(lái)改變?nèi)軇┑念愋停崛∫阂唤?jīng)濃縮就變的非?；鞚幔瑹o(wú)法過(guò)柱，若通過(guò)稀釋需要加入大量稀釋液，過(guò)柱將花費(fèi)大量時(shí)間；另一方面，HLB柱和PEP-2柱專屬性不強(qiáng)，對(duì)飼料凈化效果差，因此選擇了回收率好，專屬性強(qiáng)的PWAX柱。

圖1 空白配合飼料色譜圖

圖2 空白添加配合飼料色譜圖(靛藍(lán)為2 mg/kg、亮藍(lán)為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(靛藍(lán)為2 mg/kg、亮藍(lán)為0.5 mg/kg、其他色素為1.0 mg/kg)

化合物名稱PWAX/%C18/%HLB/%PEP-2/%檸檬黃95.284.697.998.3莧菜紅95.775.396.493.9靛藍(lán)10094.198.6107.8胭脂紅93.372.997.496.8桔黃96.991.998.897.9食品紅101.592.598.9103.5亮藍(lán)9491.498.192.8

PWAX柱為弱陰離子交換柱，色素在酸性條件下在柱子上有較好的保留，因此需要優(yōu)化提取液的pH值，同時(shí)為了保證上樣液合適的離子強(qiáng)度，首先對(duì)提取液進(jìn)行稀釋，取10 mL提取液，加入20 mL水和一定量甲酸，將上樣液pH調(diào)至2、3、4、5、6進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)pH值大于等于3時(shí)，亮藍(lán)已有較大的損失，因此加入甲酸(約3.2 mL)將上樣液pH調(diào)至2左右。同時(shí)也對(duì)淋洗液和洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化，淋洗液為5 mL 2%甲酸溶液，5 mL 80%甲醇(1%甲酸水)，5 mL甲醇。洗脫液為5 mL 10%氨化甲醇。

本方法基于高效液相色譜法，利用弱陰離子交換柱凈化飼料中的雜質(zhì)，建立了測(cè)定飼料中7種水溶性色素的液相色譜法，確定了提取凈化條件以及液相色譜條件，顯示了較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足飼料中7種水溶性飼料的檢測(cè)要求。

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(編輯：侯向輝)

Simultaneous Determination of 7 Kinds of Water-soluble Pigments in Feeds by High Performance Liquid Chromatography

MENG Lei1，ZHOU Hong-xia1，LI Hui-su1，PENG Li1，MA Hao-xuan2，WU Ning-peng1*

(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugControl,Zhengzhou450008，China；2.ZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

WUNing-peng,E-mail:wnppeking2002@163.com

A method based on high performance liquid chromatography was developed for quantitative analysis of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds. The conditions of sample preparation and analysis were optimized in this thesis. The pigments were firstly extracted with 40 mL of acetonitrile-propanediol-water-ammonia water (25∶5∶19∶1)by twice and purified by PWAX SPE column.A HPLC separation was carried on an Agilent-C18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-0.02 mol/L ammonium(pH=5.0) for gradient elution and detected using a UV detector at 425 nm，500 nm，630 nm. The method was quantified by the external standard method and the linear ranges for 7 kinds of pigments were in the range of 0.5(1.0)-50 μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999. The average recoveries ranged from 60.6% to 116.1% of 7 kinds of pigments in feeds at four different levels withRSDless than 7.3%.The limits of detection were 0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，1.0 mg/kg and the limits of quantitation were 0.5mg/kg，1.0 mg/kg，2.0 mg/kg. The results indicated that the method developed was highly sensitive and selective in determination of 7 kinds of water-soluble pigments in feeds.

water-soluble pigments；feeds；high performance liquid chromatography

2016年國(guó)家畜禽產(chǎn)品未知危害因子識(shí)別與已知危害因子安全性評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2016007) 作者簡(jiǎn)介： 孟蕾，碩士研究生，從事飼料獸藥質(zhì)量檢測(cè)工作。

吳寧鵬。E-mail：wnppeking2002@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.07

2016-10-11

A

1002-1280 (2017) 07-0034-08

S859.2