羅瓊，李延鵬，王宏飛，同戈，張曉楠，朱啟運(yùn)，李慧敏，陳瑞愛(ài)*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642; 2.廣東省獸用生物制品生物技術(shù)研究與企業(yè)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東肇慶526238；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046)

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雞新城疫基因Ⅶ型滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)最小有效免疫劑量的研究

羅瓊1,2，李延鵬2，王宏飛2，同戈2，張曉楠2，朱啟運(yùn)3，李慧敏1，陳瑞愛(ài)2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642; 2.廣東省獸用生物制品生物技術(shù)研究與企業(yè)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東肇慶526238；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046)

為科學(xué)指導(dǎo)雞新城疫基因Ⅶ型滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)的臨床免疫劑量，通過(guò)測(cè)定免疫雞HI抗體滴度和攻毒保護(hù)試驗(yàn)，進(jìn)行了10日齡和30日齡SPF雞最小有效免疫劑量的研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用10 μL、20 μL和40 μL三種不同免疫劑量，免疫疫苗后21 d檢測(cè)HI抗體效價(jià)，10日齡SPF雞001批次疫苗HI抗體平均效價(jià)依次為4.8、6.2和6.5，攻毒保護(hù)率依次為80%、100%和100%，30日齡SPF雞HI抗體平均效價(jià)依次為5.0、6.3和6.5，攻毒保護(hù)率依次為70%、100%和100%。結(jié)果表明，新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)HI 抗體效價(jià)和保護(hù)效力呈正相關(guān), 免疫劑量與HI 抗體效價(jià)和保護(hù)效力也呈正相關(guān)。用NDV基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，兩種日齡雞在20 μL的免疫劑量下，疫苗仍能達(dá)到良好的免疫保護(hù)效果。

雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗；基因Ⅶ型；最小有效免疫劑量

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起禽類的一種高度接觸性傳染病，該病具有發(fā)病急、死亡快和死亡率高等特點(diǎn)，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展。不同NDV分離株間的毒力差異大，嚴(yán)維巍等[1]在2000年首次報(bào)道了基因Ⅶ型NDV在中國(guó)大陸的存在。2001年劉華雷等[2]選取1994年以來(lái)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的代表株進(jìn)行遺傳分析證實(shí)，所分離的毒株在裂解位點(diǎn)的氨基酸序列均符合NDV的強(qiáng)毒株特征，通過(guò)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明，選取的8株病毒中有7株為基因Ⅶ型新城疫病毒。雖然基因Ⅶ型NDV 的毒力指標(biāo)和其他強(qiáng)毒株相似，但該型毒株感染雞的脾臟、胸腺、法氏囊及盲腸扁桃體的病變程度均明顯高于II 型和V 型毒株[3]。因此研制基因Ⅶ型NDV疫苗十分必要。

蘭州獸醫(yī)研究所于2008年在廣東省某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)病雞只中分離得到一株NDV，命名為NDV/Chicken/Guangdong/2008/G7(Newcastle disease virus G7，簡(jiǎn)稱NDV G7)，利用NDV F基因1～374 bp核苷酸分型發(fā)現(xiàn)，該分離株為NDV基因Ⅶd亞型[4]。利用已建立的反向遺傳操作平臺(tái)，將基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒 G7株的NP蛋白缺失18個(gè)氨基酸，并對(duì)F蛋白裂解位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得NDV低毒力標(biāo)記疫苗毒株MG7株，該毒株毒力明顯減弱，NP蛋白缺失18個(gè)氨基酸可與野毒株有明顯區(qū)分(可以做為標(biāo)記疫苗使用)，對(duì)病毒的基因修飾不影響其在雞胚上的復(fù)制能力，該毒株適合于ND疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制備基因Ⅶ型新城疫標(biāo)記疫苗。本研究進(jìn)行了雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)對(duì)雞的最小有效免疫劑量的測(cè)定試驗(yàn)，為疫苗每羽份劑量的確定提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)用疫苗 實(shí)驗(yàn)室制備的3批雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)，批號(hào)為001、002、003，2～8 ℃保存。

1.2 SPF雞 SPF雞由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司禽蛋分公司提供，動(dòng)物房隔離器內(nèi)按SPF雞飼養(yǎng)要求飼養(yǎng)，供試驗(yàn)使用。

1.3 檢驗(yàn)用試劑 MG7抗原和陽(yáng)性血清由蘭州獸醫(yī)研究所制備保存。

1.4 效檢用雞新城疫病毒 雞新城疫基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7株由蘭州獸醫(yī)研究所分離純化并保存。

2 方 法

2.1 不同劑量疫苗免疫試驗(yàn) 取10日齡SPF雞100只隨機(jī)分成10組，每組10只雞。編號(hào)1-10組。其中第1-3組免疫批號(hào)為001的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第4-6組免疫批號(hào)為002的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第7-9組免疫批號(hào)為003的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第10組為空白對(duì)照。取30日齡SPF雞100只，免疫劑量和分組情況均與10日齡SPF雞相同。

2.2 抗體水平測(cè)定 在雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)接種當(dāng)天和接種后21 d，分別采血，分離血清。用MG7抗原檢測(cè)免疫當(dāng)天ND的HI抗體水平及免疫后21 d的ND HI抗體水平，求出幾何平均值。

2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 采取與1.2.1 同樣的分組方法，取10日齡SPF雞100只隨機(jī)分成10組，每組10只雞。編號(hào)1-10組。其中第1-3組免疫批號(hào)為001的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第4-6組免疫批號(hào)為002的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第7-9組免疫批號(hào)為003的雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗，免疫劑量依次為10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第10組為空白對(duì)照。取30日齡SPF雞100只，免疫劑量和分組情況均與10日齡SPF雞相同。免疫后21 d，免疫組和攻毒對(duì)照組注射G7強(qiáng)毒，肌肉注射0.5 mL每羽(含105ELD50)，攻毒后觀察有無(wú)新城疫臨床癥狀，觀察14 d，測(cè)定雛雞對(duì)新城疫強(qiáng)毒攻擊的被動(dòng)免疫保護(hù)效力。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，對(duì)病毒分離陰性的，應(yīng)在SPF雞胚盲傳一代后進(jìn)行判定。

3 結(jié) 果

3.1 抗體水平測(cè)定 10日齡SPF雞使用不同劑量免疫雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)，21 d時(shí)進(jìn)行HI抗體測(cè)定，免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示3批次實(shí)驗(yàn)室試制的疫苗在40 μL免疫組的HI抗體效價(jià)大于6.5，20 μL免疫組的HI抗體效價(jià)大于6.2，10 μL免疫組的HI抗體效價(jià)不高于5.5，結(jié)果表明ND 滅活疫苗HI 抗體效價(jià)與免疫劑量呈現(xiàn)正相關(guān)(表1)。

雞日齡免疫劑量/μL疫苗批號(hào)HI抗體雞日齡免疫劑量/μL疫苗批號(hào)HI抗體10日齡100014.8±0.540025.5±0.530035.1±0.39200016.2±0.590026.4±0.390036.2±0.35400016.5±0.410026.8±0.350036.6±0.39空白對(duì)照/1±0.4730日齡100015.0±0.330025.3±0.480035.6±0.5200016.3±0.540026.4±0.390036.1±0.46400016.5±0.330027.0±0.370036.8±0.54空白對(duì)照/1.1±0.32

/空白對(duì)照組雞全部健活

/Chickens of blank control group were all alive

3.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫劑量與HI 抗體效價(jià)和抗攻毒保護(hù)效果呈正相關(guān)。20 μL免疫組即可有效抵御新城疫強(qiáng)毒G7株的攻擊，攻毒對(duì)照組5 d內(nèi)全部死亡，20 μL及以上免疫劑量組全部獲得保護(hù)。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離，40 μL免疫組均未分離到病毒；20 μL免疫組有1只雞可以分離到病毒；10 μL免疫組有3只雞可以分離到病毒(表2)。

30日齡SPF雞以不同劑量免疫雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)，21 d時(shí)進(jìn)行HI抗體測(cè)定，ND 滅活疫苗HI抗體效價(jià)與免疫劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，3批次實(shí)驗(yàn)室試制的疫苗在40 μL免疫組的HI抗體效價(jià)均大于6.5，20 μL免疫組的HI抗體效價(jià)均大于6.1，10 μL免疫組的HI抗體效價(jià)不高于5.6。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫劑量與HI抗體效價(jià)和抗攻毒保護(hù)呈正相關(guān)。20 μL免疫組，能有效抵御新城疫強(qiáng)毒G7株的攻擊，攻毒對(duì)照組5 d內(nèi)全部死亡，20 μL及以上免疫劑量組全部獲得保護(hù)。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離，40 μL免疫組均未分離到病毒；20 μL免疫組有2只雞可以分離到病毒；10 μL免疫組有2只雞可以分離到病毒(表2)。

上述結(jié)果表明，10日齡和30日齡SPF雞，在20 μL免疫劑量下，接種后21 d HI抗體效價(jià)達(dá)到6以上，利用新城疫基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7株攻毒后，可以獲得100%保護(hù)，病毒分離陽(yáng)性率不高于20%。

表2 不同日齡SPF雞攻毒保護(hù)試驗(yàn)Tab 2 Challenge protection test of SPF chickens at different ages

/攻毒對(duì)照組在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡

/Chickens of the poison control group were all dead within 5 days after the attack

4 討 論

目前國(guó)內(nèi)外使用的疫苗株LaSota為基因II型，距今已有70 多年的歷史。NDV持續(xù)進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了多個(gè)基因型，在臨床使用中常發(fā)生疫苗株與流行毒株基因型不一致的情況，這也是免疫雞群中發(fā)生非典型ND 的主要原因。使用與流行毒株相同基因型的疫苗株可有效預(yù)防NDV 流行強(qiáng)毒株的感染[5]。疫苗的好壞能直接影響免疫保護(hù)期的長(zhǎng)短及免疫效果，而疫苗里邊抗原含量是疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)，進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體的抗原需要有一定的數(shù)量才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這個(gè)量的大小取決于抗原的抗原性強(qiáng)弱，好的抗原少量即可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高水平的免疫抗體，提供良好的免疫保護(hù)。提高抗原量能增強(qiáng)免疫效力，過(guò)量則引起免疫副反應(yīng)也增加成本，確定最小有效免疫劑量為疫苗使用給用戶提供理論依據(jù)，做到既確保免疫有效，又不增加副反應(yīng)和成本。

本研究利用不同日齡(10日齡和30日齡)的SPF雞進(jìn)行了雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)的最小有效免疫劑量研究，結(jié)果表明，疫苗免疫劑量與HI 抗體效價(jià)和攻毒保護(hù)效果呈正相關(guān)。對(duì)于兩種日齡的SPF雞，雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)免疫20 μL及以上劑量時(shí)，HI抗體效價(jià)均大于6，攻毒保護(hù)效率100%。同期利用LaSota疫苗(與MG7疫苗采用相同工藝制備)20 μL免疫組，21 d后的HI抗體效價(jià)(利用LaSota抗原測(cè)定)僅為4～5(待發(fā)表數(shù)據(jù))，表明研制的MG7株疫苗可以誘導(dǎo)更高的ND抗體效價(jià)。

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫劑量為20 μL，不同日齡雞群均能抵抗流行的基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7 的攻擊，而對(duì)照組最終全部發(fā)病死亡，顯示出了該疫苗在控制我國(guó)新城疫的流行中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)雞新城疫滅活標(biāo)記疫苗(MG7株)的最小有效免疫劑量研究，我們?cè)谂R床使用中可以更加科學(xué)合理的使用免疫劑量，以確保疫苗安全有效。

[1] 嚴(yán)維巍,王永坤,周繼宏,等.一株雞副粘病毒的分子特性研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,3(1):27-31.

Yan W W, Wang Y K, Zhou J H,etal. Molecular characterization of an unassigned avian paramyxovirus isolate[J]. Journal of Yangzhou University (Natureal Science Edition), 2000,3(1):27-31.

[2] 劉華雷,王永坤,嚴(yán)維巍,等.中國(guó)部分地區(qū)新城疫病毒的分子流行病學(xué)研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,4(1):35-40.

Liu H L, Wang Y K, Yan W W,etal. The Investigation on the molecular epizootiology of Newcastle disease virus [J]. Journal of Yangzhou University (Natureal Science Edition), 2001,4(1):35-40.

[3] Susta L, Miller P J, Afonso C L,etal. Clinicopathological characterization in poultry of three strains of Newcastle disease virus isolated from recent outbreaks[J]. Vet Pathol,2011, 48: 349-360.

[4] Liu B, Ji Y, Lin Z, Fu Y,etal. Two single amino acid substitutions in the intervening region of Newcastle disease virus HN protein attenuate viral replication and pathogenicity[J]. Scientific reports 2015, 5:13038.

[5] Miller P J, King D J, Afonso C L,etal. Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge[J]. Vaccine, 2007, 25: 7238-7246.

(編輯：李文平)

Study on the Minimum Effective Immune Dose of Genotype VII Newcastle Disease Inactivated Marker Vaccine (MG7 strain)

LUO Qiong1,2,LI Yan-peng2,WANG Hong-fei2,TONG Ge2,ZHANG Xiao-nan2,
ZHU Qi-yun3, LI Hui-min1,CHEN Rui-ai1,2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China; 2.GuangdongEnterpriseKeyLaboratoryofBiotechnologyR&DofVeterinaryBiologicalProducts，Zhaoqing，Guangdong526238，China； 3.LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046，China)

CHENRui-ai,E-mail:chensa727@126.com

In order to scientifically guide the clinical immunization dose of genotype VII Newcastle disease inactivated marker vaccine (MG7 strain), the minimum effective immune dose of 10 days and 30 days SPF chickens was studied by measuring the immunized chicken HI antibody and challenge protection test. Animal experiment using 10 μL, 20 μL and 40 μL in three different doses of 3 batches of vaccine immune, The HI antibody titers were detected 21 days after immunization, the 10 day old SPF chickens of 001 batches of vaccine HI antibody titers were 4.8, 6.2 and 6.5, protective rates were 80%, 100% and 100%. The 30 day old SPF chickens of 001 batches of vaccine HI antibody titers were 5, 6.3 and 6.5, protective rates were 70%, 100% and 100%.The results showed that there was a positive correlation between the HI antibody titer and protective efficacy after vaccination, and the immunization dose was positively correlated with HI antibody titer and protective effect. The NDV genotype VII virulent G7 strain was used to challenge protection test. The vaccine was able to achieve good immunoprotective effect at 20 μL immunization dose.

Newcastle disease inactivated marker vaccine; genotype VII; minimum effective immune dose

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B020202007) 作者簡(jiǎn)介： 羅瓊，碩士研究生，從事生物制品方面的研究。

陳瑞愛(ài)。E-mail: chensa727@126.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.01

2017-03-01

A

1002-1280 (2017) 07-0001-05

S859.797