張莉莉，楊 峰，李宏勝，王益民，劉龍海，張 哲，王 丹，張亞茹，李新圃，羅金印

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000）

奶牛乳房炎大腸桿菌的青霉素耐藥特征研究

張莉莉1，2，楊 峰1，李宏勝1，王益民2，劉龍海1，張 哲1，王 丹1，張亞茹1，李新圃1，羅金印1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000）

為了研究奶牛乳房炎大腸桿菌的青霉素耐藥特征，采用藥敏紙片法檢測(cè)了123株大腸桿菌對(duì)青霉素的耐藥性，并利用β-內(nèi)酰胺酶試劑盒測(cè)定耐青霉素株β-內(nèi)酰胺酶活性，同時(shí)采用剛果紅法和改良結(jié)晶紫半定量方法檢測(cè)生物被膜的形成能力。結(jié)果表明：123株受試大腸桿菌中，對(duì)青霉素耐藥的菌株有122株，耐藥率99.19%。122株耐青霉素大腸桿菌中，生物被膜檢測(cè)為陽性的菌株有92株（75.41%），β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)為陽性的有72株（59.02%）；β-內(nèi)酰胺酶陽性而生物被膜陰性的菌株有15株（12.30%），β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜同為陽性的有57株（46.72%）；β-內(nèi)酰胺酶為陰性但生物被膜為陽性的菌株有35株（28.69%）。92株生物被膜陽性菌株中，29株（31.52%）具有強(qiáng)成膜能力，61株（66.30%）具有中等成膜能力，2株（2.17%）成膜能力較弱。說明奶牛乳房炎大腸桿菌對(duì)青霉素的耐藥率較高；大腸桿菌青霉素耐藥性受β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜多種因子的共同調(diào)控。

奶牛乳房炎；大腸桿菌；青霉素；耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶；生物被膜

大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的常見病原菌，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。目前，抗生素療法仍是治療細(xì)菌性奶牛乳房炎的首選方法［3］。青霉素常用于治療大腸桿菌引發(fā)的乳房炎，然而由于長(zhǎng)期、廣泛、盲目的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌青霉素耐藥性菌株逐年增加，耐藥譜增寬，給臨床治療帶來了極大的困難［4］。

大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性主要依賴于菌株自身攜帶的各種相關(guān)耐藥基因［5］。青霉素耐藥基因blaZ可編碼β-內(nèi)酰胺酶，該酶能夠水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使β-內(nèi)酰胺類抗生素失活［6］。此外，隨著對(duì)耐藥機(jī)制研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)臨床上耐藥菌株的增加不僅與抗生素的不合理使用有關(guān)，也與生物被膜的形成密切相關(guān)［7］。細(xì)菌形成生物被膜吸附于惰性或活性材料表面，將自身包裹于其分泌的胞外多糖基質(zhì)形成群體結(jié)構(gòu)，致使抗菌藥物難以接近病原菌，導(dǎo)致其耐藥性明顯增強(qiáng)［8］。

近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于畜牧業(yè)生產(chǎn)中大腸桿菌青霉素耐藥性的研究日益受到重視，然而有關(guān)我國(guó)西北地區(qū)牛源大腸桿菌青霉素耐藥特征的報(bào)道相對(duì)較少。本研究以中國(guó)西北地區(qū)奶牛乳房炎病例中所分離鑒定的大腸桿菌為研究對(duì)象，研究其青霉素耐藥表型與β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜的關(guān)系，旨在為闡明我國(guó)西北地區(qū)奶牛乳房炎青霉素耐藥特征奠定基礎(chǔ)，為采取合理的防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 123株大腸桿菌菌株于2016年從甘肅地區(qū)部分奶牛場(chǎng)采集的奶牛乳房炎乳汁樣品中分離獲得，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所微生物課題組分離鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑與藥品 Mueller-Hinton培養(yǎng)基、Mueller-Hinton肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基、腦心浸出粉、蔗糖、葡萄糖（G）、無水乙醇、無水甲醇，均購(gòu)于廣東環(huán)凱生物科技有限公司；瓊脂、剛果紅、0.2%結(jié)晶紫、藥敏紙片，均購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司；β-內(nèi)酰胺酶試劑盒購(gòu)于Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［9］，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 β-內(nèi)酰胺酶活性檢測(cè) β-內(nèi)酰胺酶的測(cè)定嚴(yán)格依照β-內(nèi)酰胺酶試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.3 生物被膜定性檢測(cè) 將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液接種于剛果紅培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)及顏色。粗糙、干燥、結(jié)晶樣的黑色菌落為生物被膜陽性菌株，而紅色的光滑型菌落為生物被膜陰性菌株［10］。

1.2.4 生物被膜半定量檢測(cè) 采用結(jié)晶紫染色法，按參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。將菌液于TSB肉湯中過夜培養(yǎng)，用TSB+ 1%G培養(yǎng)液1∶100稀釋菌液，然后取200μL菌液接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清，用PBS清洗3次。每孔加入150μL無水甲醇固定20min，棄去上清，晾干。每孔加入150μL結(jié)晶紫，染色15min。棄去染液，PBS沖洗3次。每孔中加200μL無水乙醇，室溫靜止30min。酶標(biāo)儀測(cè)定OD570，陰性對(duì)照組為無水乙醇。每株細(xì)菌接種3個(gè)平行孔，結(jié)果取平均值。根據(jù)OD570值的不同將生物被膜形成能力分為4類：OD≤ODC，無成膜能力（－）；OD＜ODC≤2OD，弱成膜能力（+）；2OD＜ODC≤4OD，中等成膜能力（++）；OD＞4ODC，強(qiáng)成膜能力（+++）。

2 結(jié)果與分析

123株大腸桿菌受試菌株中，對(duì)青霉素耐藥的有122株，耐藥率達(dá)99.19%。

由表1可知，122株耐青霉素大腸桿菌中，生物被膜檢測(cè)為陽性的菌株有92株（75.41%），β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)為陽性的有72株（59.02%）；β-內(nèi)酰胺酶陽性而生物被膜陰性的菌株有15株（12.30%），β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜同為陽性的有57株（46.72%）；β-內(nèi)酰胺酶為陰性但生物被膜為陽性的菌株有35株（28.69%），β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜同為陰性的菌株有15株（12.30%）。對(duì)92株生物被膜檢測(cè)為陽性的大腸桿菌生物被膜形成能力分析，結(jié)果顯示：29株（31.52%）具有強(qiáng)成膜能力，61株（66.30%）具有中等成膜能力，2株（2.17%）成膜能力較弱（圖1）。

表1 122株耐青霉素大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜定性檢測(cè)

圖1 92株耐青霉素大腸桿菌生物被膜形成能力分析

3 討論

大腸桿菌是引發(fā)奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，大量耐藥菌株的出現(xiàn)給抗菌藥物治療大腸桿菌性奶牛乳房炎帶來了新的難題，其中大腸桿菌青霉素耐藥菌株尤為突出。我國(guó)學(xué)者王禮偉等［12］的研究結(jié)果表明，新疆石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌青霉素耐藥率高達(dá)100%；王娟［13］報(bào)道，揚(yáng)州地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌青霉素耐藥率大于90%。在本實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌對(duì)青霉素的耐藥率99.19%，與上述報(bào)道相近。該結(jié)果可能與青霉素長(zhǎng)期、大量、不規(guī)范地用于治療奶牛乳房炎密切相關(guān)［14］。

β-內(nèi)酰胺酶是大多數(shù)臨床分離病原菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要因素［15］。劉玉文等［16］研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對(duì)青霉素和氨芐青霉素耐藥率均為98.2%。本研究中，大腸桿菌青霉素耐藥菌株中，59.02%的菌株β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)為陽性，說明β-內(nèi)酰胺酶在大腸桿菌青霉素耐藥性中發(fā)揮著重要作用，此結(jié)果與管海寧等［17］的報(bào)道相似；40.98%的菌株β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)為陰性但表現(xiàn)為青霉素耐藥，推測(cè)其對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性可能是依賴于其他耐藥機(jī)制如生物被膜的形成［18］。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，超過80%的細(xì)菌感染與生物被膜的形成相關(guān)，細(xì)菌形成生物被膜后，對(duì)抗生素的耐藥性可增加10～1000倍［19-20］。本實(shí)驗(yàn)中，75.41%的大腸桿菌青霉素耐藥菌株可產(chǎn)生生物被膜，且主要為強(qiáng)成膜能力和中等成膜能力菌株，此結(jié)果與賈艷華等［21］報(bào)道的數(shù)據(jù)相近。此外，46.72%的菌株β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜均檢測(cè)為陽性，說明生物被膜不僅在牛源大腸桿菌的青霉素耐藥性中發(fā)揮著重要作用，而且生物被膜的產(chǎn)生也可增加β-內(nèi)酰胺酶的活性［22］。

細(xì)菌對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜，β-內(nèi)酰胺酶或生物被膜雖然在細(xì)菌產(chǎn)生青霉素耐藥性中發(fā)揮重要作用，但對(duì)青霉素耐藥的菌株并不意味著一定會(huì)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶或生物被膜［23］。本實(shí)驗(yàn)中，122株青霉素耐藥菌株中，15株β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜同檢測(cè)為陰性，可能是因?yàn)榧?xì)菌菌體表面的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein，PBP）變異降低了與青霉素的親和力所致［24］，具體原因還需進(jìn)一步的研究和分析。

綜上所述，奶牛乳房炎大腸桿菌對(duì)常用抗生素青霉素的耐藥率較高，建議臨床上給藥前先做診斷，以便選擇合適藥物進(jìn)行治療；大腸桿菌青霉素耐藥性受β-內(nèi)酰胺酶和生物被膜等多種因子共同調(diào)控。

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Penicillin-resistant Characterization of Escherichia coli Isolated from Bovine Mastitis

Zhang Lili1，2，Yang Feng1，LiHongsheng1，etal
（1.Lanzhou InstituteofHusbandryand PharmaceuticalScienceofCAAS，Key Laboratory ofVeterinary PharmaceuticsDiscovery，MinistryofAgriculture，Key LaboratoryofNew AnimalDrug ProjectofGansu Province，Lanzhou 730050，China；2.SchoolofPublic Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

The aim of this studywas to investigate the penicillin resistantcharacterization of Escherichia coli isolated from bovine mastitis.The penicillin resistance was determined by disk diffusion method，β-lactamase test kit was used to detect the β-lactamase activity，biofilm formation was tested with Congo red Agar and semi-quantitative adherence assay method.The results showed that，in all tested E.coli，122 isolateswere resistant to penicillin，the resistance ratewas 99.19%.Among the 122 penicillin-resistant E.coli strains，72（59.02%）isolateswere identified asβ-lactamase producers，and 92（75.41%）isolates produced biofilm.In addition，15（12.30%）biofilm-negative strain was identified asβ-lactamase producer.Meanwhile，57（46.72%）isolateswerepositive forboth ofβ-lactamaseand biofilm，35（28.69%）β-lactamase-negativestrainswere identified as biofilm producers.The results of semi-quantitative adherence assaymethod showed that，among the 92 isolates bioflm producer，29（31.52%）weredetected asstrongbioflm producer，61（66.30%）weredetected asmoderatebioflm producer，and 2（2.17%）were detected asweak bioflm producer.The study indicated that E.coli exhibited high resistance rates to penicillin，and implied that E.coli resistant to penicillinwasattributed tomultiplemechanisms.

bovinemastitis；Escherichia coli；penicillin；resistance；β-lactamase；biofilm

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.010

S823.7

A

2095-3887（2017）04-0038-04

2017-05-08

項(xiàng)目期金：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81402703，81550046）

張莉莉（1989-），女，碩士研究生。

李宏勝（1964-），男，研究員，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及預(yù)防。