袁 凱 王錫昌 張 龍 谷東陳 郭小溪 樊震宇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

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基于IR和PLS的銀耳中亞硫酸鹽快速定量檢測

袁 凱 王錫昌 張 龍 谷東陳 郭小溪 樊震宇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

采用紅外光譜技術(shù)，通過探究亞硫酸鹽殘留量對銀耳中特定化學(xué)官能團含量變化的影響，揭示銀耳漂白機理，并基于二者的聯(lián)系建立一種快速定量檢測銀耳中亞硫酸鹽殘留量的方法。模擬硫磺熏蒸工藝，制備不同亞硫酸鹽含量水平的銀耳樣品，并通過碘滴法檢測所制備樣品中亞硫酸鹽含量的真實值，收集不同樣品的紅外光譜圖，分析譜圖差異，從而建立基于偏最小二乘法(PLS)的定量檢測模型。結(jié)果表明：硫磺熏蒸通過破壞維生素B2的羥基自由基從而實現(xiàn)漂白目的。且紅外定量檢測銀耳中亞硫酸鹽含量模型的R為0.980 4，RMSECV為0.97。該方法具有快速、定量和無損檢測食品中亞硫酸鹽的潛力。

亞硫酸鹽；銀耳；快速檢測；紅外光譜；偏最小二乘法；化學(xué)建模

銀耳又稱作白木耳、銀耳子、雪耳等，是中國特有的真菌類食藥原材料[1]。在銀耳傳統(tǒng)干制加工中，常常運用硫磺熏蒸這一工藝。硫磺熏蒸具有漂白和消毒作用，能減緩果蔬內(nèi)部發(fā)生的一系列化學(xué)變色反應(yīng)，同時能夠抑制微生物的滋生[2-4]。但硫磺熏蒸工藝無法控制亞硫酸鹽(以SO2計)的殘留量，易導(dǎo)致亞硫酸殘留量超標(biāo)，危害人體健康，因此硫磺熏蒸這一傳統(tǒng)工藝在中國被嚴格禁止[5]。但銀耳市場中依舊存在以顏色判定質(zhì)量的錯誤消費理念，刺激了某些不良商家仍采用這一高危害的加工技術(shù)制作超白銀耳。

針對亞硫酸鹽和二氧化硫在食品及藥材中殘留的問題，各國相繼制定出系列規(guī)定和標(biāo)準，同時研究并建立其檢測方法，國際上常采用MW法(Monier-Williams)，中國多采用氮滴定蒸餾法和離子色譜法，日本多采用鹽酸副玫瑰胺比色法[6]。但這些方法存在耗時長、檢測成本高等缺陷。一些快檢方法相繼出現(xiàn)，包括電化學(xué)法[7]、色度比色法[8]、近紅外熒光探針法[9]，雖在檢測耗時上有極大的改善，但靈敏度低，對樣品破壞程度大，實際使用效果不佳。近年來，為探究更加便捷，有效的檢測方法，將近紅外光譜技術(shù)運用于面粉非法添加的檢測[10]及魚糜品質(zhì)評價[11]等領(lǐng)域且取得了良好的效果，其快速、無損的檢測優(yōu)勢也受到廣泛的認可。因此，本試驗擬采用該技術(shù)建立食品中亞硫酸鹽殘留量的檢測方法，旨在為市售銀耳的食用安全檢測和預(yù)防工作提供一定的參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

銀耳：盛耳牌，購于上海臨港古棕路農(nóng)工商超市；

藥用硫磺：食品級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、碘滴定液：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

KBr：光譜級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：ME104E型，瑞士梅特勒-托利多公司；

高速粉碎儀：CT410型，丹麥福斯公司；

紅外光譜儀及單點ATR附件：Nicolet iS5型，美國賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將100 g銀耳置入熏染室，取3 g硫磺放入石棉瓦上，點燃搪瓷中的酒精用以引燃硫，當(dāng)硫磺形成明顯的藍色火焰后，放入空白銀耳樣品進行硫熏處理(圖 1)。硫熏后取出并放入真空干燥箱內(nèi)，45 ℃條件下干燥24 h。干燥后的銀耳用高速粉碎儀粉碎并過120目篩，將原始硫熏銀耳標(biāo)記為A-1。將原始硫熏銀耳和銀耳空白樣本按一定比例配制成不同亞硫酸鹽含量的銀耳樣本，將原始硫熏銀耳與銀耳空白按質(zhì)量比5∶1混合，記作5/1(A-2)，其他各組依次標(biāo)記為2/1 (A-3)、1/1 (A-4)、1/2 (A-5)和1/5 (A-6)。

1. 熏蒸室 2. 銀耳樣品 3. 鏤空隔板 4. 酒精燈 5. 硫磺

1.2.2 精確檢測銀耳中亞硫酸鹽含量的方法 參考GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的檢測》中的碘滴定法。準確稱取5 g銀耳樣品置于裝有250 mL超純水和沸石的圓底蒸餾燒瓶中，再加入10 mL鹽酸(6 mol/L)，加熱至微沸并保持3 min后，通過碘標(biāo)液(0.01 mol/L)滴定游離的二氧化硫至產(chǎn)生藍色且20 s內(nèi)不褪色。通過碘溶液的消耗量折算出二氧化硫的含量，其中1 mL碘標(biāo)液相當(dāng)于0.640 6 mg二氧化硫。

1.2.3 紅外光譜的采集 取樣品1 mg與 溴化鉀100 mg混合并進行壓片制樣，紅外單點ATR的參數(shù)設(shè)置為掃描范圍550～4 000 cm-1；分辨率4 cm-1；16次平行。經(jīng)傅里葉紅外光譜儀獲取原始譜圖，再經(jīng)基線校準和譜圖校準得到傅里葉紅外光譜。為降低信噪比、提高譜圖表觀分辨率，傅里葉紅外光譜經(jīng)7點Savitsky-Golay平滑和二階導(dǎo)數(shù)，獲得二階導(dǎo)數(shù)紅外譜圖。將銀耳樣品放入樣品池，以外界溫度的改變?yōu)槲_，溫度范圍30～70 ℃，升溫速率2 ℃/min，不同溫度的動態(tài)原始譜圖每5 ℃采集1次，并使用SpectraCorr軟件處理后，獲取二維紅外光譜圖。

1.2.4 定量模型的構(gòu)建 銀耳樣本以校正集∶驗證集為3∶1的比例被隨機選取。通過比較3種化學(xué)計量學(xué)(CLS、SMLR 和PLS)的建模效果，選取最佳化學(xué)計量法。并采取150組銀耳樣本在TQ Analyst軟件中優(yōu)化亞硫酸鹽的定量檢測模型。隨后，采取t檢驗驗證3組未知亞硫酸鹽含量銀耳的模型預(yù)測值和其真實值的顯著性差異。其中未知亞硫酸鹽含量的真實值由碘滴定測得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的亞硫酸鹽含量

采用通氮滴定蒸餾法檢測所制備的不同水平亞硫酸鹽含量的銀耳樣本(A-1～A-6)的亞硫酸鹽殘留量分別為 24.26，20.21，16.22，12.18，8.15，3.96 mg/g，不同樣品在表觀上存在顯著差異，隨著亞硫酸殘留量的增加，銀耳樣品越發(fā)顯白，同時黃色逐漸變淺(圖 2)。

圖2 不同混合梯度下制備的亞硫酸鹽不同含量的銀耳樣品

2.2 三級紅外光譜分析

2.2.1 FT-IR分析 由圖3可知，3 346 cm-1處的吸收峰(vas，N—H)主要由糖類和蛋白質(zhì)引起，2 925，2 854 cm-1的吸收峰(v，CH2)和1 737 cm-1的吸收峰(vs，C═O)歸屬于脂質(zhì)，且1 043 cm-1處的吸收峰(δ，C—O)來源于纖維素。隨著銀耳中亞硫酸鹽含量增加，屬于纖維素的碳氧單鍵伸縮振動峰強逐漸減少，因此1 043 cm-1吸收峰的峰強可用來鑒定銀耳是否被硫磺熏染。

2.2.2 SD-IR分析 紅外二階導(dǎo)數(shù)譜能有效區(qū)分傅里葉紅外光譜的重疊峰，從而增強譜圖的表觀分辨率和擴大紅外譜圖的細微差異[12]。為此，采用紅外二階導(dǎo)數(shù)譜進一步分析不同水平殘留銀耳的譜圖差異。隨著銀耳中亞硫酸鹽含量的增加，983 cm-1處吸收峰的蜂強顯著增強，見圖3。尤其是，根據(jù)亞硫酸鹽的標(biāo)準紅外譜圖(圖4)可知，983 cm-1處吸收峰歸屬于亞硫酸基團的反對稱伸縮振動。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜驗證了硫磺通過燃燒反應(yīng)變成亞硫酸鹽并附著于銀耳上。然而，二階紅外導(dǎo)數(shù)光譜無法清晰揭示硫磺熏染漂白銀耳的機制。

圖3 空白銀耳和不同亞硫酸鹽含量銀耳的傅里葉紅外譜圖和二階導(dǎo)數(shù)譜圖

Figure 3 FT-IR spectra and SD-IR spectra oftremellablank andtremellawith various contents of sulfite

圖4 亞硫酸鹽和維生素B2的標(biāo)準紅外光譜圖

2.2.3 2DCOS-IR分析 為了進一步分析二氧化硫在銀耳中所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，采用二維相關(guān)紅外光譜(2DCOS-IR)對硫磺熏染前后的銀耳進行分析。二維相關(guān)紅外光譜能擴大譜圖分辨率且提供更多由于外界微擾而引起的分子變化信息，從而定性和定量區(qū)分物質(zhì)[13]。以銀耳中不同亞硫酸含量為外界微擾構(gòu)建二維相關(guān)譜圖，對角線上自動峰顯示對特征吸收峰的相關(guān)性和靈敏度。

在960～1 000 cm-1波段的銀耳二維紅外光譜中存在一個較強的自動峰，該峰為963 cm-1處多糖的碳氧雙鍵變形振動(δ，C═O)產(chǎn)生。然而，亞硫酸鹽的二維紅外光譜在983 cm-1處有較強的自動峰，該峰歸屬于硫氧單鍵的非對稱伸縮振動vas(S—O)，見圖 5。隨著銀耳中亞硫酸鹽含量的增加，963 cm-1處的自動峰強度逐漸降低，但983 cm-1處的自動峰強度增強。此外，隨著銀耳中亞硫酸鹽含量的增強，自動峰963，983 cm-1的交叉峰呈現(xiàn)正相關(guān)，顯示2個自動峰的變化趨勢相同。但983 cm-1處的自動峰的增強并未影響963 cm-1處的自動峰的減弱。因此硫磺熏染銀耳并未破壞銀耳內(nèi)部的多糖成分。

維生素B2在4 000～3 000 cm-1區(qū)域的二維紅外光譜中存在一個最強的自動峰為3 506 cm-1，其歸屬于羥基自由基的振動。而且，該自動峰也是硫熏銀耳的二維相關(guān)紅外譜中較強吸收峰(圖6和表1)。表明銀耳中含有維生素B2。隨著銀耳中亞硫酸鹽含量的增加，3 506 cm-1處的自動峰峰強逐漸減弱，而且維生素B2呈現(xiàn)黃色。表明維生素B2中羥基自由基在硫熏過程中被破壞。維生素B2的氧化和其他色素的破壞共同導(dǎo)致了銀耳的漂白，其中維生素B2中羥基自由基的破壞在硫熏漂白過程中起到重要作用。

2.3 定量建模

由于紅外譜圖數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，譜圖的有效信息需要經(jīng)過化學(xué)計量學(xué)提取出來。因此，紅外定量模型常需要依靠化學(xué)計量學(xué)包括經(jīng)典最小二乘的模式識別方法(CLS)，逐步多元回歸(SMLR)和偏最小二乘法(PLS)來構(gòu)建。本研究分別采用3種化學(xué)計量學(xué)方法來構(gòu)建銀耳中亞硫酸鹽含量的定量模型，并通過比較3種定量模型的擬合程度來優(yōu)化出最適化學(xué)計量學(xué)方法。其中，模型的R和RESECV值用來評估擬合情況和準確度?；谏鲜?組硫熏銀耳和空白銀耳樣品建立3種化學(xué)計量學(xué)模型的擬合效果見表2。結(jié)果表明，基于PLS建模的擬合效果最優(yōu)。

圖5 1 000～960 cm-1波段范圍內(nèi)銀耳標(biāo)樣、亞硫酸鹽以及不同亞硫酸鹽含量銀耳樣品的二維同步相關(guān)光譜圖

圖6 4 000～3 000 cm-1波段范圍內(nèi)銀耳標(biāo)樣、維生素B2以及熏染不同質(zhì)量硫黃的銀耳樣品的二維同步相關(guān)光譜圖

采取150個不同硫熏銀耳來優(yōu)化基于PLS的定量模型，其擬合效果R為0.980 4，RMSECV為0.97(圖7)。通過采取3組硫熏銀耳(13.75，21.50，33.84 mg/kg)來交叉驗證模型的準確性和應(yīng)用性。通過碘滴法來獲取其真實值，驗證組銀耳的亞硫酸鹽含量，再和紅外定量模型給出的預(yù)測值進行t檢驗(表3)。結(jié)果表明，模型結(jié)果不存在顯著性差異，能用于快速定量檢測銀耳中亞硫酸鹽的含量。

表1 維生素B2的紅外光譜主要特征吸收峰

圖7 基于FT-IR光譜定量測定亞硫酸鹽含量的PLS定量模型

不同模型R值RMSECV值CLS0.92661.53SMLR0.94392.11PLS0.96881.03

表3 銀耳中亞硫酸鹽含量的定量模型的精度檢驗

3 結(jié)論

本研究基于紅外光譜揭示了硫熏銀耳漂白的機理，并構(gòu)建了快速定量檢測銀耳中亞硫酸殘留量的模型。結(jié)果表明，隨著硫熏銀耳的亞硫酸鹽含量增加，傅里葉紅外光譜中1 043 cm-1處峰強逐漸減少，表明可通過該吸收峰強度判斷銀耳是否被硫熏。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜驗證了硫磺通過燃燒反應(yīng)后最終形成亞硫酸鹽并附著于銀耳上。二維相關(guān)紅外光譜進一步揭示，硫熏破壞了銀耳中維生素B2中羥基自由基，從而實現(xiàn)硫熏漂白銀耳的目的。采用3種化學(xué)計量法(CLS、SMLR和PLS)比較建模發(fā)現(xiàn)，基于PLS的紅外定量模型具有良好的擬合效果(R為0.980 4；RMSECV為0.97)。t檢驗表明，定量模型具有良好的準確性和適用性。該方法能用于快速、定量檢測食品中亞硫酸鹽的殘留量，為近年來多發(fā)的食品安全問題的檢測和預(yù)防工作提供一定的參考和指導(dǎo)。

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Rapid and quantitative determination of sulfite residue intremellabased on IR spectroscopy and PLS

YUAN Kai WANG Xi-chang ZHANG Long GU Dong-chen GUO Xiao-xi FAN Zhen-yu

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The change regulation of the content chemical functional group intremellasamples with different setting levels of sulfite content was explored by using the infrared spectroscopy, and the mechanism of bleaching was further revealed. A rapid quantitative method testing the sulfite residue intremellawould be established. Moreover, the true content of sulfite content was detected by biodine drop method. The infrared spectra of the samples with different levels of residual sulfur were collected and analyzed, and the quantitative detection model based on partial least squares(PLS)was builded. The result indicated that the sulphur fumigation bleachingtremellathrough destroying the hydroxyl radicals of vitamin B2. Moreover, IR quantitative prediction model for sulfite residue intremellabased on PLS has been established withRof 0.980 4 and RMSECV of 0.97. This approach showed well potential to provide a rapid, nondestructive and quantitative method for detecting the sulfites residue in food.

sulfite residue;tremella; a rapid quantitative method; IR spectroscopy; chemometric methods

上海海洋大學(xué)與大山合集團有限公司的橫向研究項目(編號：D-8006-14-0075)

袁凱，男，上海海洋大學(xué)在讀碩士研究生。

王錫昌(1964—)，男，上海海洋大學(xué)教授，博士。 E-mail：xcwang@shou.edu.cn

2017—03—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.013