湯 婷 劉燕燕 蔣愛民 蔣 卓

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

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脈沖電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)與金屬離子螯合作用的影響

湯 婷 劉燕燕 蔣愛民 蔣 卓

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

采用拉曼光譜研究脈沖電場(chǎng)對(duì)卵清蛋白與金屬離子(Cu2+、Ba2+、Mn2+或 Ca2+)螯合作用的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：① PEF處理時(shí)間和金屬離子種類都能影響金屬離子和蛋白質(zhì)的螯合作用，隨著脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)，金屬離子與卵清蛋白的螯合作用增強(qiáng)，PEF處理時(shí)間為1 695 μs時(shí)，Mn2+和Cu2+與蛋白質(zhì)的鰲合開始減弱；② 蛋白質(zhì)分子和金屬離子在1 200～1 700 cm-1位置出現(xiàn)不同程度的螯合：與Mn2+鰲合最強(qiáng)，Cu2+和Ca2+較弱，Ba2+最弱。

脈沖電場(chǎng)；卵清蛋白；拉曼光譜；金屬離子；螯合作用

脈沖電場(chǎng)(Pulsed Electric Fields，PEF)處理技術(shù)是一種新型的食品綠色加工技術(shù)[1-2]，能在保持食品風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分的前提下[3-4]，不可逆破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，殺死病原微生物和腐敗微生物，達(dá)到殺菌的目的[5-6]，并在鈍酶、消除農(nóng)殘、物質(zhì)提取等方面都有增強(qiáng)效應(yīng)[7-9]。通過圓二色譜、熒光光譜等方法研究PEF對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，已有數(shù)據(jù)[10-11]表明PEF誘導(dǎo)酪氨酸和色氨酸的構(gòu)象改變，二硫鍵和疏水基團(tuán)的暴露，α-螺旋和β-折疊等結(jié)構(gòu)的改變。張芳等[12]研究表明，金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)引起氨基酸殘基周圍的化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致這些殘基化學(xué)位移發(fā)生改變。金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合可能是高度專一的、緊密的，也可能是瞬態(tài)的、松散的。由于金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能特性的改變，金屬離子在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能方面都起著關(guān)鍵作用[13]。因此，本研究采用脈沖電場(chǎng)調(diào)控金屬離子和蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而得到理想的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。

拉曼光譜是一項(xiàng)能夠在不破壞生物組織、分子的前提下，對(duì)活體生物、細(xì)胞以及蛋白水溶液進(jìn)行光譜采集，進(jìn)而提供蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的直接分析技術(shù)[14-16]。相對(duì)于傅立葉紅外轉(zhuǎn)換光譜和圓二色譜，它能提供更廣泛的結(jié)構(gòu)信息，包括脂肪族氨基酸的C—H基團(tuán)等氨基酸的側(cè)鏈信息。研究表明，通過拉曼光譜研究不同條件對(duì)蛋白質(zhì)變性的影響[17]，還可通過觀察O—H的伸縮變化研究蛋白質(zhì)和水的相互作用[18]。

本試驗(yàn)以卵清蛋白(Ovalbumin)為原料，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19-21]對(duì)卵清蛋白的拉曼圖普解析知識(shí)，利用拉曼光譜檢測(cè)PEF對(duì)蛋白質(zhì)與金屬離子鰲合作用的影響，為脈沖電場(chǎng)在食品中更廣泛的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白：白蛋白，美國(guó)Sigma公司；

脈沖電場(chǎng)處理裝置：SY-Z-500型，華南理工大學(xué)食品與食品學(xué)院研制；

低溫冷凍液循環(huán)泵：DLSK-3/10型，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

恒流泵：BT100-2J型，英國(guó)Longer公司；

數(shù)顯電導(dǎo)率儀：DDS-11A型，上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-18N型，寧波新芝生物科技有限公司；

拉曼光譜儀：LabRAM Aramis型，法國(guó)H.J.Y公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵清蛋白處理流程 配制10 g/L卵清蛋白溶液，透析12 h后，使電導(dǎo)率低于180 μs/cm，分別以摩爾比1∶3，1∶4，1∶6，1∶4加入Cu2+，Ba2+，Mn2+，Ca2+。在不同脈沖條件下獲得PEF處理樣品，冷凍干燥后，待用。

1.2.2 脈沖電場(chǎng)參數(shù) 脈沖寬度20 μs，電場(chǎng)強(qiáng)度20 kV/cm，流速25 mL/min，樣品接受電脈沖處理時(shí)間分別為565，1 130，1 695，2 260 μs。

1.2.3 拉曼光譜分析 將處理樣品放在拉曼顯微鏡下，激光波長(zhǎng)785 nm，光柵600 grades/cm，激光功率>30 mW，夾縫寬度50～800 μm，掃描范圍100～400 cm-1，掃描時(shí)間20 s，積分5次。所有圖片均使用ORIGIN 9.0 繪制處理。

1.3 拉曼光譜中特征波段的指認(rèn)

蛋白質(zhì)構(gòu)象或構(gòu)型的變化引起拉曼激光的散射程度呈現(xiàn)不同的吸收峰位置、強(qiáng)度和退偏比，從而得到氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象信息及其微環(huán)境的變化情況等。拉曼譜圖中不同波段的卵清蛋白分子基團(tuán)和結(jié)構(gòu)信息見1。

表1 拉曼光譜中特征波段的指認(rèn)[19-21]

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬離子對(duì)卵清蛋白分子微觀結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)合圖1和表1，添加金屬離子后，相對(duì)空白樣，卵清蛋白的微觀結(jié)構(gòu)改變，金屬離子和卵清蛋白分子在1 700～1 200 cm-1位置存在差異性螯合：添加Mn2+、Cu2+和Ba2+分別在1 700～1 200 cm-1，1 400～1 200 cm-1和1 660 cm-1，1 458 cm-1和1 660 cm-1處出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，添加Ca2+不存在明顯的結(jié)構(gòu)變化，說明Mn2+鰲合作用最強(qiáng)，Ba2+和Cu2+次之，Ca2+最弱。

金屬離子(Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ca2+)的加入，引起760 cm-1和840 cm-1吸收峰變化，表明金屬離子引起色氨酸和酪氨酸殘基基團(tuán)狀態(tài)改變，說明蛋白質(zhì)分子微環(huán)境變化；而995，1 458，1 660 cm-1附近峰峰強(qiáng)增強(qiáng)，說明金屬離子影響卵清蛋白分子中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，脂肪酸側(cè)鏈C—H彎曲和酰胺Ⅰ帶無規(guī)則結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子極性環(huán)境增強(qiáng)。3 000～2 800 cm-1波段的吸收峰發(fā)生變化，加入Ca2+，吸收峰強(qiáng)度峰強(qiáng)減?。患尤隡n2+、Ba2+和Cu2+，吸收峰強(qiáng)度增加，說明金屬離子影響卵清蛋白分子中脂肪族側(cè)鏈C—H伸縮，Ca2+誘導(dǎo)其微環(huán)境極性減小，Mn2+、Ba2+和Cu2+誘導(dǎo)其微環(huán)境極性增強(qiáng)。

圖1 金屬離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.2 脈沖電場(chǎng)對(duì)添加Ca2+的卵清蛋白分子微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖2和表1可知，對(duì)比未經(jīng)PEF處理的加Ca2+的卵清蛋白圖譜，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，1 672 cm-1處吸收峰向低波段遷移至1 660 cm-1，且峰強(qiáng)明顯增強(qiáng)，說明PEF能量的輸入引起卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶β-折疊減少，無規(guī)則結(jié)構(gòu)增多，蛋白質(zhì)分子展開增強(qiáng)；1 454 cm-1吸收峰峰強(qiáng)增強(qiáng)，說明PFF誘導(dǎo)脂肪族側(cè)鏈C—H彎曲，微環(huán)境極性增強(qiáng)；1 400～1 200 cm-1波段的吸收峰峰強(qiáng)增強(qiáng)，說明PEF引起C—H平面彎曲和C—N伸縮增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子微環(huán)境極性改變，即PEF誘導(dǎo)Ca2+和蛋白質(zhì)分子在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強(qiáng)。

同時(shí)，PEF處理誘導(dǎo)在541，763，946 cm-1峰強(qiáng)度增強(qiáng)，說明PEF引起蛋白質(zhì)分子脂肪族側(cè)鏈構(gòu)象和色氨酸周圍環(huán)境改變，以及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多；對(duì)于2 800～3 050 cm-1波段的峰，隨著脈沖處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2 970 cm-1附近峰峰形更趨均一單峰，說明PEF引起脂肪族側(cè)鏈C—H伸縮振動(dòng)，微環(huán)境極性增強(qiáng)[1]。

圖2 PEF協(xié)同Ca2+影響卵清蛋白分子Raman圖

2.3 脈沖電場(chǎng)對(duì)添加Cu2+的卵清蛋白分子微觀結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)PEF處理后，添加Cu2+的卵清蛋白分子得到拉曼光譜圖見圖3，在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強(qiáng)。隨著PEF處理時(shí)間延長(zhǎng)，1 400～1 200 cm-1波段吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，其中1 260 cm-1吸收峰向低波段遷移，且峰強(qiáng)增加，說明PEF誘導(dǎo)卵清蛋白分子酰胺Ⅲ帶結(jié)構(gòu)變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，無規(guī)則結(jié)構(gòu)增多；1 596 cm-1開始出現(xiàn)吸收峰，其峰強(qiáng)隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大，說明PEF增強(qiáng)了C—H伸縮和N—H變形振動(dòng)；1 660 cm-1峰強(qiáng)增大，說明PEF誘導(dǎo)酰胺Ⅰ帶無規(guī)則結(jié)構(gòu)增多。

同時(shí)在500，775，960，1 450 cm-1峰強(qiáng)先增加后降低(在處理時(shí)間為1 695 μs時(shí)開始降低)，說明PEF誘導(dǎo)卵清蛋白分子中脂肪族側(cè)鏈的構(gòu)象變化，色氨酸包埋殘基、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)先增加后減少，蛋白分子的微環(huán)境極性先增強(qiáng)后減弱，1 695 μs時(shí)蛋白質(zhì)開始變性。850，830 cm-1代表酪氨酸酚羥基及酪氨酸的狀態(tài)，I850/I830用來指示酚羥基基團(tuán)的氫鍵以及酪氨酸包埋或暴露的狀態(tài)。I850/I830增大，說明PEF誘導(dǎo)賴氨酸酚羥基基團(tuán)氫鍵增多，酪氨酸被包埋程度增加；2 957 cm-1處的明顯吸收峰逐漸變?yōu)槎鄠€(gè)小雜峰，說明PEF影響脂肪族側(cè)鏈C—H伸縮振動(dòng)，微環(huán)境極性減弱。

圖3 PEF協(xié)同Cu2+離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.4 脈沖電場(chǎng)對(duì)添加Ba2+的卵清蛋白分子微觀結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)合圖4和表1，隨著脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間延長(zhǎng)，添加Ba2+的卵清蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化：1 600 cm-1峰消失，說明PEF誘導(dǎo)C—H伸縮振動(dòng)和N—H變形振動(dòng)變化，酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)變化；1 660 cm-1峰強(qiáng)先增大后減小，可能是PEF先打亂卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)，然后誘導(dǎo)無規(guī)則結(jié)構(gòu)增加；同時(shí)，1 400～1 200 cm-1波段吸收強(qiáng)度逐漸增大，其中1 260 cm-1處吸收峰增大，說明PEF引起卵清蛋白分子酰胺Ⅲ帶結(jié)構(gòu)變化，α-螺旋增加；結(jié)果表明PEF誘導(dǎo)添加Ba2+的卵清蛋白分子展開減少，即Ba2+和蛋白質(zhì)分子在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強(qiáng)。

753 cm-1峰強(qiáng)增大，說明卵清蛋白分子中色氨酸側(cè)鏈殘基暴露程度，以及對(duì)微環(huán)境的敏感性增強(qiáng)；經(jīng)PEF處理后，945 cm-1吸收峰消失，當(dāng)PEF處理時(shí)間達(dá)到2 260 μs時(shí)，吸收峰又重新出現(xiàn)，且峰強(qiáng)增大，說明短時(shí)間電脈沖處理會(huì)使卵清蛋白分子中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)展開，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到一定時(shí)，會(huì)影響其C—C骨架振動(dòng)，重新形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；同時(shí)，未進(jìn)行PEF處理的卵清蛋白在3 000～2 800 cm-1波段為多個(gè)小雜峰，經(jīng)PEF處理后的在3 000～2 800 cm-1波段的吸收峰逐漸趨于單峰，最終在2 931 cm-1處形成均一單峰，說明PEF引起脂肪族側(cè)鏈C—H伸縮振動(dòng)，微環(huán)境極性增強(qiáng)[1]。

圖4 PEF協(xié)同Ba2+離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.5 脈沖電場(chǎng)對(duì)添加Mn2+的卵清蛋白分子微觀結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)合表1，由圖5可知，PEF在1 700～1 200 cm-1對(duì)Mn2+和蛋白質(zhì)分子的螯合作用明顯。對(duì)比未經(jīng)PEF處理的Mn2+卵清蛋白，隨著PEF處理時(shí)間延長(zhǎng)，在1 400～1 200 cm-1波段的吸收強(qiáng)度逐漸減小，說明PEF影響卵清蛋白中C—H平面彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)，結(jié)果表明PEF誘導(dǎo)添加Mn2+的卵清蛋白分子展開減少，即PEF誘導(dǎo)Mn2+和蛋白質(zhì)分子在1 400～1 200 cm-1位置螯合減弱，可能是PEF擾亂蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，影響了與金屬離子的鰲合作用；1 600 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，說明PEF引起卵清蛋白中酰胺鍵C═O伸縮，即PEF誘導(dǎo)Mn2+和蛋白質(zhì)分子在1 600 cm-1螯合作用增強(qiáng)；1 660 cm-1處吸收峰隨PEF處理時(shí)間延長(zhǎng)而變化，說明565 μs時(shí)卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)被打亂，經(jīng)PEF進(jìn)一步處理，其無規(guī)則結(jié)構(gòu)開始增多，處理1 695 μs后蛋白可能發(fā)生變性，無規(guī)則結(jié)構(gòu)減少并保持穩(wěn)定狀態(tài)。

515，750 cm-1的吸收峰峰強(qiáng)逐漸增強(qiáng)，說明PEF誘導(dǎo)卵清蛋白分子中S—S伸縮變化，脂肪族側(cè)鏈的構(gòu)象變化，色氨酸的包埋殘基減少，酰胺Ⅰ帶無規(guī)則結(jié)構(gòu)減少，對(duì)微環(huán)境的敏感程度減弱；946 cm-1處峰的位置和吸收強(qiáng)度均隨處理時(shí)間發(fā)生變化，說明PEF誘導(dǎo)卵清蛋白分子中C—C骨架振動(dòng)變化，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)改變；2 910 cm-1處的強(qiáng)吸收峰逐漸變?yōu)槎鄠€(gè)小雜峰，說明PEF影響脂肪族側(cè)鏈C—H伸縮振動(dòng)，微環(huán)境極性改變。

圖5 PEF協(xié)同Mn2+影響卵清蛋白分子Raman圖

3 結(jié)論

經(jīng)過大量試驗(yàn)證明，金屬離子過量會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。卵清蛋白和金屬離子主要在1 700～1 200 cm-1波段具有鰲合作用，且不同金屬對(duì)卵清蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響不同，其中，Mn2+影響最大，Ca2+影響最小，可能與電子層數(shù)和電子云密度有關(guān)。

PEF對(duì)金屬離子和卵清蛋白鰲合作用的影響主要表現(xiàn)在加強(qiáng)1 700～1 200 cm-1波段吸收峰峰強(qiáng)。金屬離子不同，影響程度也不同。其中，Mn2+影響最大，Ba2+最小，可能是由電子云密度造成的，Ba2+電子云密度最大，PEF穿透最難，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化最小，因而對(duì)鰲合作用造成的影響最小。PEF處理時(shí)間對(duì)金屬離子和卵清蛋白的鰲合作用也會(huì)造成影響，整體而言，處理時(shí)間與加強(qiáng)鰲合程度呈正相關(guān)，但不同金屬離子影響不同。

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Study on chelating of metal ion and protein in pulsed electric field

TANG Ting LIU Yan-yan JIANG Ai-min JIANG Zhuo

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China)

The effects of pulsed electric field on chelating of ovalbumin and metal ions (Cu2+, Ba2+, Mn2+or Ca2+) and the effect of pulsed electric field on the chelating effect of ovalbumin were studied by Raman spectroscopy. Results: ① PEF treatment time and metal ion species could affect the chelation of metal ions and protein, and the chelation of metal ions with ovalbumin was enhanced with the prolongation of pulse treatment time, when PEF treatment time was 1 695 μs, the chelation of Mn2+and Cu2+with protein began to weaken; ② The protein and metal ions chelated to different degrees at 1 200～1 700 cm-1, the strongest was Mn2+, followed by Cu2+and Ca2+, and the weakest was Ba2+.

pulsed electric fields; Ovalbumin; Raman spectra; metallic ion; chelation

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：21506069)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2016A030310455)

湯婷，女，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

2017—03—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.003