楊 影，曲 超

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

過氧化氫誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立

楊 影，曲 超

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

目的 探討視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建方法。方法將培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入50、100、200、300、400 μmol/LH2O2，對照組不加入H2O2，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，在培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h，采用CCK-8檢測細(xì)胞抑制率，用比色法觀察每組中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞的活力、抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)，MDA含量均有顯著升高(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論200 μmol/LH2O2作用處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是體外模擬視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的良好模型。

過氧化氫;視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞;氧化損傷

【Key words】Hydrogen peroxide;Retinal pigment epithelial cells;Oxidative damage

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)又稱為老年性黃斑變性(senile macular degeneration，SMD)，在臨床上既是常見病又是難治性疾病，常常引起患者視力下降甚至失明，且發(fā)病有逐年增加的趨勢。關(guān)于AMD的病因尚未完全明了，有研究表明人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的氧化損傷在年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病和病程發(fā)展中起重要的作用，RPE抗氧化損傷的研究將對AMD等視網(wǎng)膜疾病的治療開闊新的前景。

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于活性氧而引起的細(xì)胞損傷，過氧化氫(H2O2)是一類活性氧，其極易透過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子(Fe2+)通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生很高活性的羥自由基(·OH)，攻擊細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而引起細(xì)胞損傷［1］，但這種損傷不會(huì)造成細(xì)胞死亡，而且在適宜的保護(hù)劑作用下，這些損傷還有可能被修復(fù)［2］。由于H2O2易于獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，所以其已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具。因此，本研究2015年1月至2016年5月以RPE細(xì)胞為研究對象，以H2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，建立一種可靠的體外模擬氧自由基誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷模型，旨在為后續(xù)研究氧化損傷的機(jī)制以及抗氧化應(yīng)激藥物的篩選提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞D407細(xì)胞系由四川省人民醫(yī)院分子遺傳中心實(shí)驗(yàn)室提供，H2O2溶液(購自美國 Sigma Aldrich公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(購自美國 GIBCO公司)，MTT試劑盒、CCK-8試劑盒(購自美國 Sigma公司)，總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(購自中國LEAGENE公司，)丙二醛(MDA)測試盒(購自南京建成生物技術(shù)有限公司)，流式細(xì)胞檢測儀(美國Becton Dicknson)，Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒(美國BD公司)，超凈工作臺 (購自蘇州凈化設(shè)備有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(購自美國Shellab公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 遵守快融的原則，先將水浴鍋調(diào)至37～37.5℃，從-80℃冰箱或者液氮罐里拿出人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凍存管迅速投入37℃溫水中，并輕輕搖動(dòng)使其內(nèi)容物迅速融化(最好在1min以內(nèi))，取出凍存管，微微上下晃動(dòng)凍存管，用75%酒精消毒后開啟，用吸管吸出溶解后的細(xì)胞懸液，注入離心管并加入5 ml的含10%胎牛血清(FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)液。以800～1000 rpm離心5 min，除去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液吹打，使其形成懸浮液。用含20%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，調(diào)整細(xì)胞濃度為50×106/ml接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2d換液1次，細(xì)胞近鋪滿(80%～90%)時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的人RPE傳代細(xì)胞接種于6孔板及96孔板中。

1.2.2 H2O2濃度的篩選 將細(xì)胞按濃度1×106/ml接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后分別加入0、50、100、200、300、400 μmol/L(n=6)H2O2，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，每孔加入 20 μL 5 mg/ml MTT，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6小時(shí)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值(A490)。細(xì)胞抑制率(%)=［A(對照組)-A(實(shí)驗(yàn)組)］/A(對照組)×100%，篩選出合適的H2O2濃度。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞抑制率 收集生長良好的人RPE細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，同步化后分成正常對照組和氧化損傷組，將200 μmol/L的H2O2加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4小時(shí)。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.4 抗氧化物酶SOD活性檢測 細(xì)胞處理及分組如1.2.3，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，加入300 μl試劑A冰浴勻漿，4℃，10000 g離心10 min，收集上清，按照每個(gè)反應(yīng)1.6 ml的體積，均勻混合1 mlSOD檢測緩沖液、0.3 mlNBT顯色液、0.3 ml酶溶液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應(yīng)20 min。，以不照光的空白對照管調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)，比色杯光徑為1 cm，檢測560 nm處吸光度值。

1.2.5 MDA含量測定 細(xì)胞處理及分組同1.2.3，細(xì)胞處理結(jié)束后消化、離心收集細(xì)胞，按南京建成生物工程研究所提供的相應(yīng)試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測定530 nm處的吸光值(A530)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理及分組同1.2.3，細(xì)胞處理結(jié)束后消化、離心收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC結(jié)合液，采用Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和Turkey's多因素t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2處理對人RPE細(xì)胞活力的影響由表1可見，H2O2處理后細(xì)胞活力降低，細(xì)胞數(shù)量減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，H2O2的濃度越高，細(xì)胞存活率越低，細(xì)胞抑制率越高，當(dāng)H2O2濃度為 50、100 μmol/L，細(xì)胞存活率高于 70%，當(dāng) H2O2濃度為 300、400 μmol/L，細(xì)胞存活率低于 30%，細(xì)胞形態(tài)破壞嚴(yán)重，存活細(xì)胞過少，不宜造模;當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L，抑制率在53.20%時(shí)，損傷相對適中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，故后續(xù)試驗(yàn)選擇200 μmol/LH2O2作為細(xì)胞氧化損傷的最佳濃度。

表1 不同濃度H2O2處理對人RPE細(xì)胞活力的影響

2.2 CCK-8檢測不同作用時(shí)間H2O2對人RPE細(xì)胞活力的影響人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞的活力均出現(xiàn)極顯著降低(P＜0.01)，而且與時(shí)間成依賴性，時(shí)間越長，活力越低，見表2。

表2 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞活力的影響

2.3 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞抗氧化物酶SOD活性的影響人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)，見表3。

表3 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞抗氧化物酶SOD活性的影響

2.4 200 μmol/L H2O2處理對人 RPE細(xì)胞 MDA含量的影響人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞MDA含量均有顯著升高(P＜0.01)，見表4。

表4 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞MDA含量的影響

2.5 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞凋亡率的影響人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與時(shí)間成依賴性，見表5。

表5 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細(xì)胞凋亡率的影響 (%)

3 討論

RPE細(xì)胞的損傷、衰老及死亡在AMD發(fā)病和病程發(fā)展中起到重要作用［3］。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是許多疾病的一個(gè)重要組成部分，已經(jīng)被在許多種疾病的細(xì)胞模型中進(jìn)行研究。視網(wǎng)膜因?yàn)槠鋵τ谘鯕獾拇罅肯募安伙柡椭舅岬母邩?gòu)成比和暴露于可見光中，使視網(wǎng)膜對于氧化應(yīng)激極為敏感［4］。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成了光感受器與脈絡(luò)膜之間的血-視網(wǎng)膜屏障的外層。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞清除光感受器副產(chǎn)物等生理功能，導(dǎo)致它們整個(gè)生命過程持續(xù)暴露于一定數(shù)量的活性氧(ROS)中，包括過氧化氫和超氧化物［5，6］。盡管有多種生理性防御機(jī)制存在，來保護(hù)視網(wǎng)膜-視網(wǎng)膜色素上皮免于氧化損傷，有證據(jù)顯示累積的氧化暴露破壞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞連接和屏障的完整性，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞起泡［7，8］。這些改變使視網(wǎng)膜易于發(fā)生黃斑變性。

本研究采用MTT法檢測不同濃度H2O2處理對人RPE細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后細(xì)胞活力降低，細(xì)胞數(shù)量減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，H2O2的濃度越高，細(xì)胞存活率越低，細(xì)胞抑制率越高，當(dāng) H2O2濃度為200 μmol/L，抑制率在53.20%時(shí)，損傷相對適中，和對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故后續(xù)試驗(yàn)選擇200 μmol/LH2O2作為細(xì)胞氧化損傷的最佳濃度。同時(shí)采用CCK-8檢測人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理 2、8、24 h 后細(xì)胞活力的變化，與對照組比較細(xì)胞的活力均出現(xiàn)顯著降低，而且與時(shí)間成依賴性，說明細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建成功。

針對細(xì)胞氧化損傷相關(guān)的其他指標(biāo)，如MDA、SOD等指標(biāo)的檢測，有助于更準(zhǔn)確地描述氧化損傷模型細(xì)胞的功能，特別是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)功能的變化，進(jìn)一步確認(rèn)模型的構(gòu)建是否合理;同時(shí)觀察這些指標(biāo)在對照組和損傷組中的變化趨勢，也有助于推測和理解下一步研究中的目標(biāo)藥物發(fā)揮保護(hù)(或損傷)作用的機(jī)制［9～12］。

SOD是體內(nèi)最重要的氧自由基清除劑，其基礎(chǔ)水平代表了細(xì)胞對抗氧自由基的能力，而損傷過程中SOD下降反映了細(xì)胞遭受氧化損傷攻擊的嚴(yán)重程度。本研究中人RPE細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低，間接反映了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能損傷程度。

細(xì)胞受到H2O2損傷后，細(xì)胞內(nèi)生成大量活性自由基，引發(fā)細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成終產(chǎn)物MDA;并且大量損耗細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑如 GSH等，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化平衡，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)［13～16］，MDA 作為脂質(zhì)過氧化的天然產(chǎn)物，可以一定程度上反映ROS造成損傷的程度，本研究發(fā)現(xiàn)人 RPE 細(xì)胞經(jīng) 200 μmol/L H2O2處理 2、8、24 h后，與對照組比較細(xì)胞MDA含量均有顯著升高，說明H2O2處理引起了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)強(qiáng)烈的過氧化反應(yīng)。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)經(jīng) 200 μmol/L H2O2處理 2、8、24 h 后，與對照組比較細(xì)胞凋亡率有極顯著差異，說明200 μmol/LH2O2作用處理人RPE細(xì)胞后，誘導(dǎo)了明顯的細(xì)胞凋亡或壞死。

綜合上述，200 μmol/LH2O2作用處理人RPE細(xì)胞，不僅影響了細(xì)胞的活性、誘導(dǎo)了明顯的凋亡或壞死，而且伴隨著細(xì)胞內(nèi)ROS升高、脂質(zhì)過氧化升高、SOD耗竭等一系列變化，符合RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中應(yīng)有的反應(yīng)，且這些指標(biāo)的變化具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，損傷組和對照組間變化的幅度也均達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求，有利于體外研究和篩選抗氧化藥物，是體外模擬RPE細(xì)胞氧化損傷的良好模型。

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Development of a model of oxidative damage of human retinal pigment epithelial cells induced by hydrogen peroxide

YANG Ying，QU Chao (Department of Ophthalmology，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，610072，China)

QU Chao

Objective To develop a model of oxidative damage of retinal pigment epithelial(RPE)cells．MethodsCultured human RPE cells were divided into normal group and experimental group．The experimental group was treated with 50，100，200，300 and 400 μmol/L H2O2while the control group was not treated with H2O2．The cell growth inhibition rate was detected with MTT assay，The incubator was cultured for 2，8，and 24 h and the cell inhibition rate was detected by using CCK-8．The changes in superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured with colorimetry method．Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate．ResultsCompared to the control group，the vitality of humna RPE cells and the activity of antioxidant enzyme SOD were significantly reduced after 2，8 and 24 hours of treatment(P ＜ 0.05)，but MDA content was significantly increased(P ＜ 0.01)．Apoptosis rate were significantly higher in the control group when compared to the experimental group(P ＜ 0.01)．ConclusionHuman RPE cells treated with 200 μmol/L H2O2is an appropriate model of oxidative damage of RPE cell in vitro．

R774.1

A

1672-6170(2017)04-0018-04

2016-12-12;

2017-04-24)

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號:30504010256)

曲 超