高 芳

(浙江省臺(tái)州市第一中學(xué) 318000)

“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化”是高中生物學(xué)必修教材中的實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行酵母菌的顯微計(jì)數(shù)，并建立數(shù)學(xué)模型解釋種群數(shù)量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，還是實(shí)驗(yàn)內(nèi)容探究等方面都值得開(kāi)展。但在實(shí)際操作過(guò)程中，由于教材很多步驟沒(méi)有詳細(xì)地解釋，無(wú)菌操作和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用等技術(shù)學(xué)生未曾接觸。因此，實(shí)驗(yàn)難度較大，開(kāi)出率較低。本文針對(duì)該實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的一些疑難問(wèn)題提出解決方法，為該實(shí)驗(yàn)的廣泛開(kāi)展提供經(jīng)驗(yàn)。

1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板能否選用普通蓋玻片

買來(lái)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板沒(méi)有蓋玻片，能否使用實(shí)驗(yàn)室普通蓋玻片？若使用普通蓋玻片，會(huì)因?yàn)樯w片太小(18 mm×18 mm)而不能覆蓋全2個(gè)計(jì)數(shù)室，且質(zhì)量較輕(厚0.13～0.17 mm，約0.14～0.15 g/個(gè))，不能保證計(jì)數(shù)室的高度恒定。專用血蓋片(22 mm×26 mm)較大的面積足以蓋全2個(gè)計(jì)數(shù)室，較重的質(zhì)量(厚0.5 mm，約0.55 g/個(gè))能保證計(jì)數(shù)室的高度為0.1 mm。

2 酵母菌稀釋倍數(shù)

酵母菌數(shù)量過(guò)多時(shí)，需要進(jìn)行稀釋操作。浙科版高中生物學(xué)必修三教材中提及10倍稀釋的方法[1]，往往使學(xué)生誤解而直接進(jìn)行10倍稀釋，造成計(jì)數(shù)室酵母菌數(shù)量過(guò)少，引起實(shí)驗(yàn)誤差，此時(shí)教師應(yīng)怎樣指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行合理稀釋呢？

教師可以指導(dǎo)學(xué)生在計(jì)數(shù)前進(jìn)行稀釋的預(yù)實(shí)驗(yàn)：先對(duì)原液大致計(jì)數(shù)，根據(jù)估算數(shù)目選擇合適倍數(shù)進(jìn)行稀釋，實(shí)際操作中，最開(kāi)始的稀釋只需1～2倍即可。那么稀釋至計(jì)數(shù)多少細(xì)胞數(shù)為宜呢？教材要求“計(jì)數(shù)總數(shù)不少于300個(gè)細(xì)胞”，但當(dāng)“方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)目多于300個(gè)或者數(shù)不過(guò)來(lái)，可以用稀釋的方法”[1]。此處“計(jì)數(shù)總數(shù)不少于300個(gè)細(xì)胞”，應(yīng)是針對(duì)規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板中5個(gè)中方格的計(jì)數(shù)總數(shù)(規(guī)格為16格×25格的計(jì)數(shù)板則指4個(gè)中方格)，即要求每個(gè)中方格計(jì)數(shù)不少于60個(gè)。而“方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)目多于300個(gè)則要稀釋”，則應(yīng)是指每個(gè)中方格的計(jì)數(shù)數(shù)目。因此，實(shí)際操作時(shí)，以每個(gè)中方格計(jì)數(shù) 100個(gè)左右為宜，數(shù)量太多會(huì)使計(jì)數(shù)難度加大，太少會(huì)因稀釋過(guò)多而產(chǎn)生誤差。

3 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板看不清豎線

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在調(diào)焦清晰的情況下，即使視野清晰，也會(huì)出現(xiàn)只能看到橫線而看不到豎線的情況，此時(shí)難以確定計(jì)數(shù)室的位置，該如何解決？因?yàn)檠?xì)胞計(jì)數(shù)板線條無(wú)色，所以顯微鏡觀察時(shí)，視野光線應(yīng)調(diào)暗一些。碰到上述情況，可以將反光鏡向側(cè)面適當(dāng)?shù)胤D(zhuǎn)調(diào)試至某個(gè)角度，使得光線強(qiáng)度適當(dāng)降低，就可以清晰地看到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的豎線。

4 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板難以清洗干凈

很多人對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的清洗并不在意，在計(jì)數(shù)完成后，不及時(shí)清洗，或簡(jiǎn)單清洗晾干后便用于下次計(jì)數(shù)。而在再次鏡檢時(shí)，發(fā)現(xiàn)前次計(jì)數(shù)的酵母菌仍殘留在計(jì)數(shù)板表面，嚴(yán)重干擾再次觀察計(jì)數(shù)。怎樣才能將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板徹底清洗干凈？首先在使用后應(yīng)立即清洗，防止細(xì)胞失水后黏在計(jì)數(shù)板上。其次，可用擦鏡紙蘸取酒精擦拭，流動(dòng)水沖洗數(shù)次。如果仍然不干凈，需泡酸后用蒸餾水沖洗。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板若使用擦鏡紙擦干，會(huì)帶來(lái)雜質(zhì)，可用吹風(fēng)機(jī)吹干或讓其自然風(fēng)干。

5 加樣時(shí)先加菌液還是先蓋蓋玻片

加樣到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上時(shí)，是先滴加菌液再蓋蓋玻片，還是先蓋蓋玻片再滴加菌液？血細(xì)胞計(jì)數(shù)板表面有凹槽(圖1)，若先加菌液再蓋蓋玻片，血蓋片落下時(shí)極易產(chǎn)生氣泡，還可能造成菌液過(guò)量，計(jì)數(shù)室高度超過(guò)1 mm，這些都會(huì)造成計(jì)數(shù)誤差。因此，建議加樣時(shí)先蓋蓋玻片，在蓋玻片的邊緣滴加適量菌液，利用毛細(xì)作用將菌液滲入蓋玻片下，以保證菌液量合適，且避免氣泡的產(chǎn)生。

圖1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板側(cè)面觀模式圖

6 每組培養(yǎng)試管選用多支還是一支

酵母菌培養(yǎng)過(guò)程中，每組培養(yǎng)所使用的試管，是自始至終只用1支，還是每組多支試管，每天取其中1支計(jì)數(shù)，不重復(fù)使用？通過(guò)將這兩種情況設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如僅用1支試管，存在重復(fù)取樣帶來(lái)污染及計(jì)數(shù)體積變化帶來(lái)誤差的問(wèn)題，若試管不小心破碎，該組實(shí)驗(yàn)則不能繼續(xù)進(jìn)行。因此，建議每組選用多支試管，每天取其中1支計(jì)數(shù)，不重復(fù)使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可有效避免以上問(wèn)題。

7 繪制曲線使用單組數(shù)據(jù)還是全部數(shù)據(jù)

將不同時(shí)間段的酵母菌數(shù)繪制成曲線時(shí)，是使用單組數(shù)據(jù)繪制成多條曲線，還是將全班所有數(shù)據(jù)匯總繪制成1條曲線？利用SPSS軟件將數(shù)據(jù)擬合成S型曲線可知，僅用單組數(shù)據(jù)，每條曲線的擬合度都較低，建立數(shù)學(xué)模型存在較大誤差；把全班所有數(shù)據(jù)匯總?cè)∑骄?，曲線擬合度顯著提高，達(dá)到數(shù)學(xué)模型建立的要求。因此，建議將全部數(shù)據(jù)匯總繪制成一條曲線。

8 實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源

當(dāng)所有操作都按規(guī)范進(jìn)行，但血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的不同計(jì)數(shù)方格間、同一試管樣品的重復(fù)測(cè)量間、同一處理的不同試管間酵母菌計(jì)數(shù)仍存在較大誤差，是什么原因?qū)е碌哪?？學(xué)生親身實(shí)踐操作后，通過(guò)互相探討，普遍認(rèn)同混勻這個(gè)操作對(duì)計(jì)數(shù)誤差起到關(guān)鍵作用，且容易忽視。取樣前搖勻、稀釋后搖勻以保證菌液密度均一，加樣前吹打均勻以保證菌液隨機(jī)散布計(jì)數(shù)室，這些都是避免出現(xiàn)計(jì)數(shù)誤差的操作細(xì)節(jié)。