唐 映 陳曉華 趙瑛瑛

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 511400)

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miR-638在胃癌中表達及其與侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系

唐 映 陳曉華 趙瑛瑛

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 511400)

目的 探討miR-638在胃癌患者血清及組織中的表達及其與胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性。方法 選取234例胃癌患者的臨床資料，收集手術(shù)切除的腫塊，制作組織芯片，原位雜交檢測miR-638在胃癌組織中的表達。同期選取20例轉(zhuǎn)移性胃癌(MET組)及20例非轉(zhuǎn)移性胃癌(Tumor組)患者的血樣，提取血清總RNA，qRT-PCR檢測miR-638在血清中的表達。分析胃癌患者的臨床病理學(xué)參數(shù)(性別，年齡，腫塊大小，吸煙史，TNM分期，Borrmann分型，組織學(xué)類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠處轉(zhuǎn)移，浸潤深度，脈管浸潤)與miR-638表達水平的關(guān)系。分析miR-638的表達水平與總生存時間(OS)和無病生存時間(DFS)的相關(guān)性。結(jié)果 miR-638在轉(zhuǎn)移性胃癌患者血清中的表達水平顯著低于非轉(zhuǎn)移性胃癌患者(P<0.05)。miR-638表達水平與胃癌患者的組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、浸潤深度、脈管浸潤相關(guān)(P<0.05)，miR-638的表達與胃癌患者的OS和DFS正相關(guān)，是影響胃癌生存預(yù)后的因素。結(jié)論 miR-638在轉(zhuǎn)移性胃組織中的表達水平顯著低于非轉(zhuǎn)移性胃組織，且miR-638與胃癌的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與預(yù)后呈正相關(guān)，有可能作為轉(zhuǎn)移性胃癌的特異性分子標(biāo)志物。

miR-638；胃癌；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

胃癌是我國發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病有著明顯的地域差異胃癌手術(shù)切除后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移仍是影響胃癌患者生存和預(yù)后的一大障礙〔1〕。因此，尋找特異性的診斷或檢測轉(zhuǎn)移性胃癌的分子標(biāo)志物將具有重要的意義。MicroRNAs (miRNAs)是一類長約21～23個核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼的單鏈小RNA分子，可通過與mRNA的3'-UTR(3'-非基因編碼區(qū))之間產(chǎn)生完全的或不完全的配對，以mRNA降解的方式阻斷mRNA的蛋白翻譯〔2，3〕。作為廣泛存在的可對基因表達進行調(diào)控的分子，miRNA可參與生物體的生長、發(fā)育、衰老和死亡等多種過程的調(diào)控。miR-638在多種惡性腫瘤中低表達，如結(jié)腸癌、胃癌等，miR-638可通過磷脂蛋白D1抑制胃癌細胞的生長增殖〔4〕；miR-638也可以通過四跨膜蛋白1抑制結(jié)腸癌細胞的生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞的周期〔5〕。本研究擬探討miR-638的表達水平及與胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院2006年1～5月入院治療，經(jīng)病理學(xué)確診為胃癌的患者的臨床資料，共234例。包括已進行手術(shù)或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期胃癌。其中男132例,女102例，年齡29～80(平均年齡57.3)歲。病理類型:低分化腺癌131例,高中分化腺癌103例。所有患者均進行了手術(shù)，并留有組織樣本。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部位有腹腔，鎖骨和縱隔等；遠處轉(zhuǎn)移的部位有肝，肺，腹水和胸水等。

1.2 病例隨訪 截至2016年5月，已經(jīng)對收集到的234例符合條件且已進行腫塊手術(shù)切除的胃癌患者進行隨訪，其中生存時間以月為單位，總生存期(OS)為最終評價指標(biāo)，即從確診之日至隨訪結(jié)束(2016年5月)或者患者發(fā)生死亡的日期截止。

1.3 血清RNA的提取及鑒定 選取同期收集的20例轉(zhuǎn)移性胃癌(MET組)及20例非轉(zhuǎn)移型胃癌(Tumor組)患者的血樣，從-80℃的超低溫冰箱取出保存的血清樣本，冰上融化，簡單離心，使所有血清樣本沉到管底，每個樣本分別取150 μl加入1.5 ml的EP管中備用。每管加入3倍體積的Trizol裂解液，并用槍頭充分吹打混勻，渦旋混勻3 min，室溫放置15 min使樣本變性。按樣本量加入等體積的氯仿，振蕩器上混勻3 min，混勻室溫放置15 min。轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層液體到另一新的無RNAase EP管中，按0.5 ml異丙醇/ml Trizol的比例加入異丙醇混勻，室溫放置10 min，離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)速7 500 r/min，4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無RNase雙蒸水溶解，取1 μl測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清RNA濃度和純度的測定 取1.3中提取的RNA各1 μl，紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop 2000)測定A260與A280的比值，其中取1 μl無酶水做空白校對，當(dāng)A260/280的測量值<3，則可進行測定。在測量RNA樣本的濃度和純度前，先對樣本進行簡單離心和混勻。當(dāng)A260/A280在1.8～2.0之間時表示血清RNA的濃度合適，可進行后續(xù)實驗。

1.5 qRT-PCR檢測 以1.3中提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies,UK)說明書進行操作，以逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR kit(Qiagen,USA)說明書進行操作，檢測設(shè)備為BioRad IQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(USA)。miR-638引物由Invitrogen公司合成，U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT用于計算相對表達量，ΔΔCT =(CTmiRNA-CTU6)target-(CT miRNA-CT U6)control。反應(yīng)體系為20 μl，每組實驗設(shè)置三個復(fù)孔。

1.6 組織芯片蠟塊制作 將1.1中收集的組織樣本用2 mm的芯片針在組織芯片儀上(Minicore)進行同軸打孔處理，對組織樣本蠟塊取材，根據(jù)組織芯片設(shè)計，將所有的病例數(shù)(陰性對照2組，位置標(biāo)記點1個)在模板蠟塊上開始進行組織列陣，組織芯片的蠟塊即制作完成。對蠟塊連續(xù)切片(其中切片厚度為4 μm)，玻片經(jīng)0.1%的多聚賴氨酸防脫片處理，隨后40℃裱片，玻片置于56℃烘箱，烤片3 h，將玻片轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱，1 d后，收集玻片，保存至常溫。

1.7 HE染色 將切片在二甲苯中浸泡20 min，換用新的二甲苯再重復(fù)浸泡一次；隨后將切片置于100%的乙醇中浸泡5 min，換用新的乙醇繼續(xù)浸泡5 min，隨后依次在95%的乙醇、80%的乙醇、60%的乙醇和雙蒸水中各浸泡5 min；用蘇木素染色1 min后，立即用1%的鹽酸(HCl)-乙醇分化10 s，立即取出玻片，自來水沖洗20 s，隨后再用伊紅染色30 s。經(jīng)過雙蒸水、60%的乙醇、80%的乙醇、95%的乙醇和純乙醇浸泡脫水、透明后封片處理。注意操作的過程中要觀察組織芯片是否完好，盡量不要發(fā)生脫落。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件，兩組間比較使用成組t檢驗，多組間的數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 miR-638在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌患者血清和組織中的表達 與非轉(zhuǎn)移性胃癌患者(Tumor組)比較，miR-638在轉(zhuǎn)移性胃癌患者(MET組)血清中表達下調(diào)(P<0.01)，見圖1。miR-638在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中低表達(105例，44.87%)，在非轉(zhuǎn)移性胃癌組織中高表達(129例，55.13%)。見圖1。

2.2 miR-638表達水平與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 miR-638的表達水平與性別，年齡，吸煙史，腫瘤大小，TNM分期和Borrmann分型無顯著相關(guān)性(P>0.05)。miR-638的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，脈管浸潤，遠處轉(zhuǎn)移，組織學(xué)類型和浸潤深度具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

2.3 miR-638表達水平改變與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan-Meier曲線法分析患者的總生存期和無病生存期(圖2)。結(jié)果顯示miR-638高表達的患者總生存時間為108個月，miR-638低表達的患者總生存時間為72個月。至隨訪結(jié)束，miR-638高表達的患者中有5.12%(12/234)已死亡,而miR-638低表達的患者中有16.7%(39/234)已死亡。兩組間的OS和無病生存時間(DFS)結(jié)果顯示：miR-638高表達和低表達的OS和DFS存在顯著差異，miR-638高表達患者的OS和DFS明顯長于miR-638低表達的患者(P<0.05)，即miR-638的表達水平與預(yù)后呈正相關(guān)。

圖1 miR-638在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌患者血清和組織中的表達

組別n性別男女年齡(歲)<60≥60吸煙史腫瘤大小(cm)≥5>5TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～ⅣBorrmann分型Ⅰ～ⅡⅢ～ⅣmiR-638上調(diào)1298742577269547530998940miR-638下調(diào)1054560574860426312936936P值0.9070.2340.5760.8670.7390.594組別n組織學(xué)類型高分化型低分化型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移遠處轉(zhuǎn)移浸潤深度T1+T2+T3T4脈管浸潤miR-638上調(diào)12997329682903952miR-638下調(diào)1056999986103289P值0.0000.0180.0020.0000.000

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討 論

miRNAs可參與多種腫瘤如乳腺癌，胃癌，宮頸癌，非小細胞肺癌等的增殖、分化和侵襲等過程的調(diào)控。miRNAs與多種腫瘤的生存和預(yù)后正相關(guān)或負相關(guān)，使得miRNAs成為了新的診斷及監(jiān)測惡性腫瘤的靶向分子標(biāo)志物〔6〕。目前對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的內(nèi)在分子機制研究結(jié)果顯示miRNAs具有用于胃癌腫瘤分子標(biāo)志物的潛力,miRNAs可在胃癌的診斷、治療和預(yù)后的指示方面發(fā)揮重要的作用〔7〕。但是大多數(shù)情況下需要進行手術(shù)或穿刺，以獲得組織樣本進行檢測，限制了組織中miRNAs作為腫瘤分子標(biāo)志物的臨床應(yīng)用〔8〕。研究顯示，存在于腫瘤組織中的成熟miRNAs可通過某種方式進入血液，通過被脂質(zhì)或脂蛋白包被，以主動分泌的形式到胞外，最終進入血液〔9〕。而miRNAs為一類長21～23個核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼的單鏈小RNA分子，其穩(wěn)定性很高，不容易降解〔10〕。血液中的miRNAs的表達在惡性腫瘤狀態(tài)改變上比較靈敏，取血的方法獲得檢測樣本方法簡單，可重復(fù)。因此通過檢測血液中miRNAs的表達水平來進行惡性腫瘤的預(yù)后監(jiān)測，其可行性極高。有研究報道，血清miR-29在胃癌患者中表達下調(diào)，經(jīng)手術(shù)切除腫塊后，血清miR-29表達增加的患者預(yù)后更佳〔11〕。血清miR-21在彌漫性大B淋巴瘤患者中存在表達差異，研究證實血清miR-21的表達與患者的生存時間密切相關(guān)，即血清miR-21可作為彌漫性大B淋巴瘤診斷預(yù)后的分子標(biāo)志物〔12〕。

胃癌的手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因，轉(zhuǎn)移性胃癌的治療目前主要有以下幾種方式，包括人類表皮生長因子受體2(HER2)陽性胃癌采用曲妥珠單抗聯(lián)合卡培他濱或5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合治療或僅單純治療等〔13〕；抗血管生成的雷莫蘆單抗治療等〔4〕；抗MET陽性胃癌的順鉑聯(lián)合卡培他濱治療等和多靶點靶向或免疫治療等〔14〕。轉(zhuǎn)移性胃癌的靶向治療不斷得到肯定，作為調(diào)控腫瘤生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個過程的miRNAs，miRNAs的靶點分布也十分廣泛。研究顯示miR-638可通過靶向抑制磷脂蛋白D1的表達而發(fā)揮抑制胃癌細胞生長增殖的作用〔4〕，miR-638也可以通過靶向抑制四跨膜蛋白1發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細胞生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞周期的作用〔5〕。研究初步表明miR-638表達可以預(yù)測胃癌患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后，為血清miR-638的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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〔2016-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

唐 映(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤及內(nèi)窺鏡方面的研究。

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A

1005-9202(2017)14-3506-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.057