劉 梅 谷 玥 張家瑋 劉寶華

(長(zhǎng)春市中醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

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烏司他丁對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的影響

劉 梅 谷 玥1張家瑋1劉寶華1

(長(zhǎng)春市中醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

目的 探討烏司他丁(UTI)對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠腸黏膜屏障的影響及其作用機(jī)制。方法 SD大鼠60只分成對(duì)照組、假手術(shù)(SO)組、SAP組和UTI組。制模后每隔8 h進(jìn)行腹腔內(nèi)注射UTI(濃度1.5萬(wàn)IU/kg)作為UTI組。各治療組檢測(cè)制模后8、24、72 h血漿內(nèi)毒素水平，通過(guò)RT-PCR法和免疫組化法對(duì)腸黏膜Toll樣受體(TLR)4表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并在電鏡下觀察腸黏膜組織。結(jié)果 對(duì)照組腸黏膜未見(jiàn)TLR4表達(dá)。與對(duì)照組相比，SAP組在制模后8 h血漿內(nèi)毒素和腸黏膜TLR4表達(dá)即出現(xiàn)升高，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)進(jìn)行性增高。血漿內(nèi)毒素與腸黏膜TLR4二者明顯相關(guān)。UTI組同時(shí)點(diǎn)內(nèi)毒素、TLR4低于SAP組，電鏡下檢查發(fā)現(xiàn)病理?yè)p傷也同時(shí)減輕，24 h時(shí)最為明顯。結(jié)論 UTI能有效保護(hù)SAP發(fā)生時(shí)的腸屏障功能，其保護(hù)機(jī)制可能與腸黏膜TLR4的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

烏司他丁；Toll樣受體4，胰腺炎；腸屏障

重癥急性胰腺炎(SAP)往往導(dǎo)致胰腺壞死并繼發(fā)腹腔感染，從而產(chǎn)生腹腔室隔綜合征，繼發(fā)出現(xiàn)多器官衰竭。而SAP出現(xiàn)繼發(fā)感染，細(xì)菌一般來(lái)源于腸道細(xì)菌移位〔1〕。如果能有效保護(hù)腸黏膜功能屏障，對(duì)于預(yù)防胰腺壞死，繼發(fā)腹腔感染，降低患者的死亡率至關(guān)重要〔2〕。本研究旨在探討烏司他丁(UTI)對(duì)SAP模型大鼠腸黏膜屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制備 Wistar雄性大鼠60只，270～320 g，隨機(jī)分為對(duì)照組6只、假手術(shù)組(SO)、SAP組和UTI組均18只。戊巴比妥鈉麻醉。SO組開(kāi)腹翻動(dòng)胰腺后即關(guān)腹。SAP組采用微泵逆行胰膽管注射4%?；悄懰徕c制成SAP模型。SAP制模后腹腔定期注射UTI 1.5萬(wàn)IU/kg，間隔時(shí)間8 h，作為UTI組。分別于術(shù)后8、24、72 h采血2 ml，高速低溫離心，分離血漿后低溫保存。切取距回盲部5 cm處回腸腸段6～8 cm，部分腸組織以2.5%戊二醛固定，電鏡下觀察。部分腸組織固定后用于免疫組化檢測(cè)。其余腸組織液氮凍存用于RT-PCR檢測(cè)Toll受體(TLR)4表達(dá)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 血漿內(nèi)毒素水平 使用Mp80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，操作過(guò)程按檢測(cè)系統(tǒng)的操作流程進(jìn)行。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)腸黏膜組織TLR4表達(dá) 取凍存腸組織約100 mg，提取腸組織細(xì)胞的總RNA，取A260/A280>1.6的標(biāo)本用于實(shí)驗(yàn)。半定量檢測(cè)腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)。PCR擴(kuò)增，最后擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為356 bp。內(nèi)參照選擇β-actin。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測(cè)定目的基因表達(dá)的相對(duì)含量。

1.3 免疫組化方法檢測(cè) 腸黏膜TLR4蛋白表達(dá)：4%中性甲醛固定的腸組織，S-P法檢測(cè)TLR4表達(dá)。每例切片觀察10個(gè)具有代表性的高倍視野(400倍)，計(jì)數(shù)細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，切片中陽(yáng)性細(xì)胞比≤5%計(jì)0分， 5%～25% 1分；26%～50% 2分； 51%～75%3分；>75% 4分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組血漿內(nèi)毒素水平的動(dòng)態(tài)變化 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)間血漿內(nèi)毒素水平無(wú)變化。而SAP組在8 h即出現(xiàn)上升跡象，并呈現(xiàn)進(jìn)行性增高趨勢(shì)，制模72 h時(shí)達(dá)最高。UTI組較對(duì)照組增高，但低于SAP組，24 h時(shí)下降非常明顯(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組血漿內(nèi)毒素水平比較

與SAP組比較：1)P<0.05

2.2 各組腸黏膜TLR4 mRNA的表達(dá) 對(duì)照組腸黏膜未檢測(cè)出明顯TLR4 mRNA，SAP組表達(dá)從8 h逐漸上升，并在72 h出現(xiàn)最高水平(P<0.01)。UTI組與SAP組比較，表達(dá)量在各時(shí)點(diǎn)均有所降低，24 h組最低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組腸黏膜TLR4 mRNA表達(dá)比較

與同組8 h比較：1)P<0.01；與SAP組比較：2)P<0.05

2.3 各組腸黏膜TLR4表達(dá)比較 見(jiàn)表3。對(duì)照組腸黏膜無(wú)TLR4陽(yáng)性表達(dá)，SAP組在8 h表達(dá)即開(kāi)始升高，表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，72 h達(dá)到最高。UTI組與SAP同時(shí)點(diǎn)相比TLR4表達(dá)量明顯降低，其中24 h組最低(P<0.05)。

表3 各組腸黏膜TLR4表達(dá)比較

與SAP組比較：1)P<0.05

3 討 論

目前SAP的病死率仍居高不下。研究表明，在SAP發(fā)病早期，由于腸道缺血缺氧、缺血-再灌注損傷及微生物屏障的破壞等多種因素均直接引起患者腸屏障功能障礙。腸道是人體中最大的細(xì)菌儲(chǔ)存器官，腸屏障一旦受到損傷，腸黏膜通透性隨即增加，腸道內(nèi)細(xì)菌及產(chǎn)生的內(nèi)毒素移位，造成胰腺及胰周組織的嚴(yán)重感染，甚至誘發(fā)腹腔室隔綜合征和多器官衰竭綜合征(MODS)，使胰腺炎病情加重，死亡率上升〔3〕。

UTI能有效抑制內(nèi)源性氧自由基的產(chǎn)生，阻止多種炎癥介質(zhì)以及內(nèi)源性休克性因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、髓過(guò)氧化物酶(MPO)等產(chǎn)生，進(jìn)一步增加腸道微循環(huán)供血，起到抗休克、預(yù)防MODS的作用。UTI還可有效抑制多種消化酶的活性，這些分泌的酶均對(duì)胰腺炎發(fā)生及發(fā)展起到關(guān)鍵作用。

血漿內(nèi)毒素升高是由于在腸黏膜屏障破壞后，來(lái)源于腸道的細(xì)菌會(huì)通過(guò)淋巴系統(tǒng)和門(mén)靜脈流到血液循環(huán)，從而發(fā)生腸源性感染。而細(xì)菌的細(xì)胞壁在血液中破裂會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，可進(jìn)入血液，產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥〔4〕。故評(píng)估腸黏膜通透性時(shí)可以用血漿內(nèi)毒素水平作為腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)。TLR4表達(dá)升高說(shuō)明內(nèi)毒素對(duì)腸道黏膜屏障損傷作用加重，它是介導(dǎo)內(nèi)毒素信號(hào)傳導(dǎo)的主要受體。本研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠有效降低血漿內(nèi)毒素水平，并且降低腸黏膜TLR4表達(dá)水平。

SAP大鼠腸黏膜TLR4的持續(xù)高表達(dá)可能是介導(dǎo)腸黏膜過(guò)度炎性反應(yīng)，加重腸黏膜屏障功能障礙的重要原因，而UTI則可能通過(guò)下調(diào)腸黏膜TLR4受體的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)UTI組與同時(shí)相點(diǎn)SAP組相比較，能夠明顯降低血漿內(nèi)毒素水平，同時(shí)減輕腸黏膜病理?yè)p傷。這可能為臨床治療SAP時(shí)治療腸道屏障功能障礙提供一個(gè)新的相應(yīng)措施。

1 Zhang JW,Zhang GX,Chen HL.Therapeutic effect of Qingyi decoction in severe acute pancreatitis-induced intestinal barrier injury〔J〕.World J Gastroenterol，2015;21(12):3537-46.

2 Luan ZG，Zhang H，Ma XC，etal.Role of high-mobility group box 1 protein in the pathogenesis of intestinal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis〔J〕.Pancreas，2010;39(2)：216-23.

3 Merilainen S，Makela J，Koivukangas V，etal.Intestinal bacterial translocation and tight junction structure in acute porcine pancreatitis〔J〕.Hepatogastroenterology，2012;59(114)：599-606.

4 王思珍，李維勤.重癥急性胰腺炎腸源性細(xì)菌易位的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)用外科雜志，2013；33(6)：515-8.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)基金會(huì)“睿意基金”急診醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)基金 (No.R2015024)

劉寶華(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學(xué)研究。

劉 梅(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)急癥研究。

R657.5

A

1005-9202(2017)14-3436-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.024

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院