李蓓華 魯國洲 黃新武

(西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

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血管性癡呆大鼠腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化

李蓓華 魯國洲1黃新武

(西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

目的 觀察血管性癡呆(VD)大鼠血漿和腦組織腎素-血管緊張素(Ang)-醛固酮(ALD)系統(tǒng)(RAAS)的動(dòng)態(tài)變化。方法 經(jīng)水迷宮篩選出學(xué)習(xí)記憶能力正常雄性SD大鼠80只隨機(jī)分入正常組、模型組(1 d)、模型組(3 d)、模型組(7 d)、模型組(14 d)、模型組(21 d)、模型組(30 d)，按照設(shè)計(jì)時(shí)間梯度采用不同時(shí)點(diǎn)分別結(jié)扎左、右雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備VD模型大鼠。觀察正常組和模型組(30 d)的空間學(xué)習(xí)記憶情況，檢測血漿、腦皮質(zhì)及海馬腎素活性、AngⅡ、ALD水平以及腦組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 模型組(30 d)和正常組水迷宮數(shù)據(jù)比較差異顯著(P<0.05)，說明模型制備成功。血漿、皮質(zhì)及海馬中腎素活性、AngⅡ及ALD的水平模型組隨時(shí)間增加其水平總體呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，但腦組織與血漿水平變化無線性相關(guān)性；腦組織光鏡下病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，隨缺血時(shí)間增加腦皮質(zhì)及海馬損傷有加重趨勢(shì)。結(jié)論 RAAS在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)；腦缺血；血管性癡呆

高齡人群中血管性癡呆(VD)患者比老年癡呆有更高的死亡率〔1〕。VD發(fā)病的確切機(jī)制尚不十分清楚。近年研究提示大腦中存在獨(dú)立于外周的腎素-血管緊張素(Ang)-醛固酮(ALD)系統(tǒng)(RAAS)，具有調(diào)節(jié)大腦生理和病理性作用〔2〕。中樞RAAS中的Ang與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)〔3〕。然而在缺血性腦損傷中腦內(nèi)RAAS的變化及其作用機(jī)制至今仍未完全闡明，本文探討腦缺血所致VD的RAAS動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠100只，體重(200±10)g，SPF級(jí)，由瀘州醫(yī)學(xué)院SPF動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 碘【125I】AngⅠ(批號(hào)：20140320)、125I AngⅡ(批號(hào)：20140320)、125I ALD(批號(hào)：20140320)，由北京北方生物技術(shù)研究所提供，SN-695Bγ放射免疫計(jì)數(shù)儀(上海核輻日環(huán)一廠)、低溫離心機(jī)(ST16R)〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕、電子天平(上海精科-上海儀電科學(xué)儀器有限公司)、Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 不同時(shí)點(diǎn)永久性結(jié)扎左、右頸總動(dòng)脈造?！?〕。實(shí)行雙重結(jié)扎(結(jié)扎處間隔2 cm左右)，保證結(jié)扎穩(wěn)固阻斷血流。經(jīng)過水迷宮篩選出學(xué)習(xí)記憶能力正常雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分入：正常組、模型組(1 d)、模型組(3 d)、模型組(7 d)、模型組(14 d)、模型組(21 d)、模型組(30 d)。按照造模方法依設(shè)計(jì)時(shí)間梯度進(jìn)行手術(shù)。

1.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 選取正常組及模型30 d組行定位航行實(shí)驗(yàn)：1 w左右，每天將動(dòng)物從4個(gè)入水點(diǎn)面朝池壁輕輕放入水中，記錄大鼠從入水至找到平臺(tái)的游泳軌跡及逃避潛伏期。每次時(shí)間為120 s，如果120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將大鼠放在平臺(tái)上20 s，并記錄潛伏期為120 s。

1.3.3 標(biāo)本采集及處理 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間截止時(shí)，大鼠禁食過夜，各組取5只稱重后，1%戊巴比妥鈉0.3 ml/100 g 麻醉，腹主動(dòng)脈取血，加入配置好的抗凝真空采血管內(nèi)，4℃，3 000 r/min,離心10 min,收集血漿，-20℃保存。取血后，斷頭取腦，立即分離皮質(zhì)和海馬，稱重，勻漿，4℃3 000 r/min,離心10 min,收集上清液，-20℃保存；各組取一部分大鼠稱重后，1%戊巴比妥鈉0.3 ml/100 g麻醉，進(jìn)行心臟灌注固定，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛繼續(xù)固定過夜，包埋切片。

1.3.4 指標(biāo)檢測 血漿及勻漿指標(biāo)采用放免法進(jìn)行測定，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行測定。其中腎素活性的測定實(shí)際上是測定血漿中AngⅠ的產(chǎn)生速率，即腎素活性=(測定管AngⅠ濃度37℃-對(duì)照管AngⅠ濃度4℃)/樣品溫育時(shí)間。腦病理學(xué)檢查：各組大鼠包埋腦組織從出現(xiàn)海馬時(shí)開始連續(xù)切片，每個(gè)腦組織連續(xù)切片10張，間隔選取，HE染色。光鏡下觀察腦皮質(zhì)及海馬病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 模型組(30 d)及正常組大鼠逃避潛伏期隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加均呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì)，但模型組(30 d)大鼠減少趨勢(shì)較弱；與正常組相比較，模型組(30 d)逃避潛伏期有顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠血漿、腦皮質(zhì)及海馬腎素活性水平 血漿：與正常組相比較，模型組(7 d)、模型組(14 d)有顯著差異(P<0.05)；腦皮質(zhì)：與正常組相比較，模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)；腦海馬：與正常組相比較，模型組(14 d)、模型組(21 d)、模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)。隨時(shí)間變化，血漿、腦皮質(zhì)及海馬腎素活性水平總體呈增強(qiáng)趨勢(shì)。各組大鼠腎素活性水平相關(guān)性分析，皮質(zhì)與血漿(r=0.068，P>0.05)、海馬與血漿均無相關(guān)性(r=0.525，P>0.05)，表明皮質(zhì)和海馬與血漿腎素活性水平無線性相關(guān)關(guān)系。見表2。

2.3 各組大鼠血漿、腦皮質(zhì)及海馬AngⅡ水平 血漿：與正常組相比較，模型組(21 d)、模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)；腦皮質(zhì)：與正常組相比較，模型組(1 d)、模型組(3 d)、模型組(7 d)、模型組(14 d)、模型組(21 d)、模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)；腦海馬：與正常組相比較，模型組(14 d)、模型組(21 d)、模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)。隨時(shí)間變化，血漿、腦皮質(zhì)及海馬AngⅡ水平總體均趨向升高。各組大鼠AngⅡ水平相關(guān)性分析，皮質(zhì)與血漿(r=0.081，P>0.05)，海馬與血漿無相關(guān)性(r=0.663，P>0.05)，表明皮質(zhì)和海馬與血漿AngⅡ水平無線性相關(guān)關(guān)系。見表2。

2.4 各組大鼠血漿、腦皮質(zhì)及海馬ALD水平 與正常組相比較，模型組(1 d)、模型組(21 d)有顯著差異(P<0.05)；腦皮質(zhì)：與正常組相比較，模型組(1 d)、模型組(3 d)、模型組(7 d)、模型組(30 d)有顯著差異(P<0.05)；腦海馬：與正常組相比較，模型組(14 d)有顯著差異(P<0.05)。隨時(shí)間變化，血漿、腦皮質(zhì)及海馬ALD水平總體處于高水平波動(dòng)。各組大鼠ALD水平相關(guān)性分析，皮質(zhì)與血漿(r=0.596，P>0.05)，海馬與血漿無相關(guān)性(r=-0.176，P>0.05)，表明皮質(zhì)和海馬與血漿ALD水平無線性相關(guān)關(guān)系。見表2。

2.5 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色 正常組大鼠皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及分布正常，皮質(zhì)各層結(jié)構(gòu)正常，藍(lán)染較為均勻，排列較為規(guī)律。與正常組比較，各模型組大鼠皮質(zhì)細(xì)胞分布出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)在數(shù)量減少；胞核染色加深，胞核固縮；局部可見皮質(zhì)細(xì)胞有核溶解、核碎裂。隨腦缺血時(shí)間梯度的推進(jìn)，可見皮質(zhì)缺血病理變化，皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有一定減少，胞核外形改變、固縮，局部可見核溶解、核碎裂。見圖1。

2.6 各組大鼠腦海馬HE染色 正常組大鼠海馬細(xì)胞數(shù)量及分布正常，胞核藍(lán)染，著色較為均勻，排列緊密。與正常組比較，各模型組大鼠海馬細(xì)胞分布出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)在數(shù)量減少；胞核染色加深，可見胞核固縮，有核溶解、核碎裂。隨腦缺血時(shí)間增加，可見海馬細(xì)胞密度降低，胞核變形、固縮，核溶解、核碎裂。見圖2。

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期

與正常組比較:1)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血漿、腦皮質(zhì)及海馬腎素活性、AngⅡ、ALD水平水平

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色(×400)

圖2 各組大鼠腦海馬HE染色(×400)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ受體拮抗藥坎地沙坦與Ca2+通道阻滯劑氨氯地平的比較治療中，坎地沙坦有著明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)利尿劑同樣能夠很好地減少血容量，降低血壓，消除水腫，但卻未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)功能〔5〕。由此可以推測，RAAS在血管性腦缺血的過程中，有超越血壓調(diào)控及水鹽代謝調(diào)節(jié)的作用。RAAS在腦缺血后的損傷過程中有著重要作用，其能夠進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞損傷，有實(shí)驗(yàn)證明，AngⅡ激活轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔6〕。

本研究顯示，RAAS在VD大鼠腦皮質(zhì)和海馬中水平升高，HE染色腦皮質(zhì)及海馬缺血損傷加重，表明RAAS成為腦缺血損傷的活躍危險(xiǎn)因素。且血漿、腦皮質(zhì)及海馬腎素活性、AngⅡ、ALD水平隨缺血時(shí)間增加而總體表現(xiàn)增高趨勢(shì)，但其在腦組織與血漿間無線性關(guān)系，光鏡下病理學(xué)觀察皮質(zhì)及海馬細(xì)胞隨時(shí)間延長腦細(xì)胞損傷加重，這說明腦缺血后損傷與RAAS活性增加有一定關(guān)系，且腦組織RAAS的變化與血漿不一致，具有一定的獨(dú)立性。這為預(yù)防缺血性腦損傷提供了一個(gè)較好的方向。

1 Tschanz JT,Corcoran C,Skoog I,etal.Dementia：the leading predictor of death in a defined elderly population：the Cache County Study〔J〕.Neurology,2004;62(7):1156-62.

2 Hajjar I,Hart M,Milberg W,etal.The rationale and design of the antihypertensives and vascular,endothelial and cognitive function(AVEC)trial in elderly hypertensives with early cognitive impairment:role of the renin angiotensin system inhibition〔J〕.BMC Geriatr,2009;9(1):48.

3 Ciobica A,Bild W,Hritcu L,etal.Brain renin-angiotensin system in cognitive function:pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia〔J〕.Acta Neurol Belg,2009;109(3):171-80.

4 黃新武,李 華,秦大蓮，等.不同時(shí)點(diǎn)分別結(jié)扎左、右頸總動(dòng)脈建立大鼠血管性癡呆模型〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010;30(14)：2006-7.

5 Saavedra JM.Angiotensin Ⅱ AT(1)receptor blockers as treatments for inflammatory brain disorders〔J〕.Clin Sci(Lond),2012;123(10):567-90.

6 Lanz TV,Ding Z,Ho PP,etal.Angiotensin Ⅱ sustains brain inflammation in mice via TGF-beta〔J〕.J Clin Invest,2010;120(8):2782-94.

〔2016-04-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

黃新武(1972-)，男，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病和神經(jīng)藥理相關(guān)研究。

李蓓華(1991-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)藥理相關(guān)研究。

R96

A

1005-9202(2017)14-3423-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.018

1 西昌市人民醫(yī)院