趙永勛 趙 鵬 馮虎元 楊含騰 王洪濤 安黎哲

(蘭州大學第一醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

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RUNX3基因多態(tài)性、幽門螺桿菌感染與甘肅武威地區(qū)胃癌高發(fā)的相關性

趙永勛 趙 鵬 馮虎元1楊含騰2王洪濤3安黎哲1

(蘭州大學第一醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討人Runt相關轉錄因子(RUNX)3基因多態(tài)性、幽門螺桿菌(Hp)感染與甘肅武威地區(qū)人群胃癌高發(fā)的相關性。方法 選取武威地區(qū)118 例胃癌患者為病例組，同期健康人群112例為對照組，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測人群Hp感染狀況，通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測RUNX3基因多態(tài)性。結果 RUNX3基因rs760805位點多態(tài)性與武威地區(qū)胃癌高發(fā)有相關性，等位基因A攜帶者(包括TA和AA兩種基因型)與TT基因型相比胃癌發(fā)病風險增加1.764倍(OR=1.764，95%CI：1.005～3.097，P=0.041)；RUNX3基因rs11249206位點多態(tài)性與武威地區(qū)胃癌高發(fā)沒有相關性。病例組和對照組Hp感染陽性率分別為68.6 % 和51.8 %，二者差異顯著(P=0.009)，Hp感染與RUNX3基因rs760805位點多態(tài)性存在交互作用，胃癌發(fā)病風險增加2.377倍(OR=2.377，95%CI：1.092～5.171，P=0.027)。結論 RUNX3基因rs760805位點多態(tài)性與武威地區(qū)胃癌高發(fā)相關，與Hp感染存在交互作用。

RUNX3；胃癌；基因多態(tài)性；幽門螺桿菌

我國屬于世界胃癌高發(fā)地區(qū)，而甘肅省武威地區(qū)又屬于我國胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌發(fā)生是多因素共同參與的過程，是環(huán)境因素和宿主遺傳因素共同作用的結果，近年研究表明胃癌發(fā)生與幽門螺桿菌(Hp)感染密切相關。人Runt相關轉錄因子(RUNX)3基因是一種定位于染色體1p36的抑癌基因，在細胞生長發(fā)育過程中起重要作用，RUNX3表達缺失與胃癌發(fā)生發(fā)展關系密切〔1〕。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因組可遺傳變異的主要形式，能夠影響人類疾病易感性。已有研究表明RUNX3基因多態(tài)性與結直腸癌〔2〕、乳腺癌〔3〕、膀胱癌〔4〕及胃癌〔5，6〕發(fā)生有相關性，RUNX3基因rs760805和rs11249206位點多態(tài)性與中國漢族人群胃癌易感性密切相關〔6〕。本研究探討RUNX3基因rs760805和rs11249206位點多態(tài)性、Hp感染與武威地區(qū)漢族人群胃癌高發(fā)的相關性，同時研究RUNX3基因多態(tài)性和Hp感染在胃癌發(fā)生中的交互作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2012年6月至2014年12月在甘肅省武威地區(qū)，包括武威市人民醫(yī)院和武威腫瘤醫(yī)院住院的漢族胃癌患者118例為病例組，胃癌患者全部經(jīng)胃鏡或手術后病理組織學證實，均未接受放、化療，男78例，女40例，平均年齡(54.53±9.12)歲；≥60歲者58例；吸煙者44例，飲酒者60例，有Hp感染者81例。另選取從同期該兩所醫(yī)院門診及體檢中心收集健康漢族人群112例為對照組，均排除消化系統(tǒng)疾病及家族中有腫瘤病史者，男70例，女42例，平均年齡(53.12±8.23)歲；≥60歲者54例；吸煙者44例，飲酒者47例，有Hp感染者58例。兩組均在武威地區(qū)居住期滿20年以上。抽取兩組外周靜脈血4 ml置于-80℃低溫冰箱儲存待測。均知情同意，本研究方案經(jīng)蘭州大學第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。兩組年齡、性別、吸煙和飲酒等基線資料均衡可比(P均>0.05)。

1.2 Hp感染檢測 取外周靜脈血2 ml分離血清，再取25 μl血清，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測Hp IgG抗體(福建三強公司試劑盒)。如果Hp IgG>20 U/ml 為陽性，判定為Hp感染。操作步驟嚴格按試劑盒說明書方法進行。

1.3 限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術分析RUNX3基因多態(tài)性

1.3.1 基因組DNA的提取 取抗凝全血2 ml，離心后去除血漿，加入2 ml人紅細胞裂解液，震蕩混勻3 min，再次離心30 s，沉淀分離白細胞，加入細胞裂解液后，嚴格按BBI柱式血液基因組DNA提取試劑盒(BIO BASIC INC 生物公司)說明書操作提取基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計和合成 參照文獻〔6〕合成引物，RUNX3基因rs760805位點，上游引物序列為：5′-TCTCCCACTCAGCAGTTCACAC-3′，下游引物序列為：5′-CTGGCGCATATTGAGAGCTGTA-3′；RUNX3基因rs11249206位點，上游引物序列為：5′-AAATGATTACTGGCCCATTTCTCATA-3′，下游引物序列為：5′-TTCTCTTGGCCCCATTTCTG-3′，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.3 PCR反應 PCR反應體系總量為25 μl，2×Taq Plus MasterMix(北京天根生物技術有限責任公司) 12.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各1 μl，DNA模板2 μl，ddH2O補足到25 μl。PCR反應條件：94℃預變性2 min，三步法94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μl 凝膠電泳(1.5%瓊脂糖凝膠，80 V)，凝膠成像系統(tǒng)拍照確認PCR擴增后產(chǎn)物，rs760805 片段大小為174 bp，rs11249206片段大小為206 bp，然后再進行酶切分型。

1.3.4 RUNX3基因分型檢測 限制性內切酶Cla Ⅰ(貨號D1034)和Afa I(貨號D1116)(TaKaRa，大連寶生物技術有限公司)分別用于rs760805 T>A和rs11249206 T>C擴增產(chǎn)物進行特異性酶切。取PCR產(chǎn)物15 μl，2倍緩沖液上樣液3 μl，限制性內切酶(10 U/μl)1 μl，ddH2O補足到30 μl。輕輕混勻后放置于37℃恒溫水浴箱中消化過夜，次日酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)判讀結果。rs760805 T>A野生純合子基因型TT，電泳時產(chǎn)生174 bp 1條條帶，雜合突變基因型TA可以產(chǎn)生174 bp，152 bp和22 bp 3條條帶，純合突變基因型AA可產(chǎn)生152 bp和22 bp兩條條帶，22 bp片段因為太小在凝膠上難以分辨(圖1)。rs11249206 T>C野生純合子基因型TT，電泳時產(chǎn)生206 bp 1條條帶，雜合突變基因型TC可以產(chǎn)生206 bp，182 bp，和24 bp 3條條帶，純合突變基因型CC可產(chǎn)生182 bp和24 bp 2條條帶，24 bp片段因為太小在凝膠上難以分辨(圖2)。根據(jù)凝膠成像結果直接判讀出每個個體基因型。

M：Marker；T、A：等位基因圖1 PCR-RFLP法分析RUNX3基因rs760805位點T>A凝膠電泳圖

M：Marker；T、C：等位基因圖2 PCR-RFLP法分析RUNX3基因rs11249206位點T>C凝膠電泳圖

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，等位基因和基因型頻率的分布用Hardy-Weinberg平衡檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對危險度。

2 結 果

2.1 RUNX3基因多態(tài)性頻率和遺傳平衡檢驗 兩組RUNX3基因rs760805和rs11249206位點多態(tài)性頻率分布，均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)。見表1。

2.2 RUNX3基因多態(tài)性與胃癌高發(fā)的相關性 以RUNX3 rs760805位點TT基因型的OR為1.00，單獨攜帶TA或AA基因型個體與TT攜帶者患胃癌的風險無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但如果將攜帶TA和AA基因型合并，與TT基因型者相比較，則攜帶TA和AA基因型者具有顯著增高的胃癌發(fā)病風險，增加1.764倍(OR=1.764，95%CI：1.005～3.097，P=0.041)。以RUNX3 rs11249206位點TT基因型的OR為1.00，則無論單獨攜帶TC或CC基因型還是合并TC和CC基因型，與TT攜帶者相比較患胃癌的風險均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

2.3 Hp感染與RUNX3基因rs760805位點多態(tài)性交互作用對胃癌高發(fā)的影響 病例組和對照組Hp感染陽性率分別為68.6%(81/118)和51.8%(58/112)，差異顯著(P=0.009)。在RUNX3基因rs760805位點，同時攜帶TA或AA兩種基因型頻率在病例組Hp感染陽性率〔26.3%(31/118)〕顯著高于對照組〔10.7%(12/112)，P=0.027〕，與攜帶TT基因型個體相比，胃癌的易感性顯著增加，增加2.377倍(OR=2.377，95%CI：1.092～5.171，P=0.027)。而Hp感染陰性同時攜帶TA或AA兩種基因型頻率在病例組與對照組無顯著性差異〔11.2%(14/118) vs 15.2%(17/112)，P=0.530〕。

表1 病例組與對照組RUNX3基因型頻率分布〔n(%)〕

3 討 論

RUNX3基因是Runx家族成員之一，位于人染色體1p36上，總長約為67 kb，該基因作為一個新的抑癌基因，在許多腫瘤中都呈失活狀態(tài)，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后多方面都發(fā)揮著重要作用。在消化系統(tǒng)腫瘤中RUNX3基因在肝癌、胰腺癌、結直腸癌及胃癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Hp感染增強胃癌組織Runx3基因甲基化〔7〕，減弱Runx3基因mRNA表達水平〔8〕，降低Runx3蛋白表達、相反誘導iNOS 蛋白高表達〔9〕，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，影響胃癌患者生存率及預后。 RUNX3基因作為轉化生長因子(TGF)信號通路中非常關鍵的轉錄因子，對細胞的生長發(fā)育和凋亡起很重要的調節(jié)作用，與多種腫瘤發(fā)生相關。Wu等〔6〕研究了312例胃癌患者和329例對照人群，發(fā)現(xiàn)RUNX3基因rs11249206位點T>C多態(tài)性與中國漢族人群胃癌發(fā)病相關，CC基因型相比TT基因型發(fā)病風險增加1.75倍(OR=1.75，95%CI：1.03～2.99)；RUNX3基因rs760805位點T>A多態(tài)性與中國漢族人群胃癌發(fā)病也相關，AA基因型相比TT基因型發(fā)病風險增加1.82倍(OR=1.82，95%CI：1.14～2.92)，而且這兩種基因型存在加乘作用，同時攜帶這兩種基因型的人群患胃癌風險進一步增加，這種風險在年齡高于65歲，不吸煙、不飲酒的人群中更加顯著。Lim等〔5〕研究了434例胃癌患者和431例對照人群，發(fā)現(xiàn)RUNX3基因rs7528484位點和rs6672420位點多態(tài)性與韓國人群腸型胃癌發(fā)病顯著相關，而與彌漫性胃癌發(fā)病沒有關系，RUNX3基因rs6672420位點A>T多態(tài)性TT基因型相比AA基因型發(fā)病風險增加1.49倍(OR=1.49，P=0.002 8)。RUNX3基因這些多態(tài)性位點位于啟動子區(qū)，基因型改變導致相應啟動子功能改變，從而上調核因子(NF)-κB轉錄活性、提高白細胞介素(IL)-1β表達量，而這些轉錄因子含量升高，通常也和Hp感染等炎癥因子刺激胃黏膜發(fā)生病理改變產(chǎn)生相同生物學效應，最終導致胃癌發(fā)生。Tsai等〔10〕在臺灣地區(qū)人群中研究發(fā)現(xiàn)RUNX3基因492位點A等位基因攜帶者在Hp感染后更易發(fā)生胃癌，RUNX3基因與臺灣地區(qū)胃癌遺傳易感性有關。Hishida等〔11〕研究了583例胃癌患者和1 637例對照人群，發(fā)現(xiàn)RUNX3基因rs760805位點T>A多態(tài)性與Hp感染日本人群慢性萎縮性胃炎顯著相關，AA基因型相比TT基因型發(fā)病風險增加1.59倍(OR=1.59，95%CI：1.08～2.33)，而該基因rs760805位點T>A多態(tài)性無論是否Hp感染都與日本人群胃癌易感性沒有相關性，說明RUNX3基因多態(tài)性與日本人群胃癌發(fā)生或許作用在起始階段，也就是處于慢性萎縮性胃炎的癌前病變階段。本課題表明RUNX3基因rs760805位點T>A多態(tài)性與武威地區(qū)漢族人群胃癌易感性相關，而RUNX3基因rs11249206位點多態(tài)性與武威地區(qū)漢族人群胃癌易感性沒有相關性。就RUNX3基因rs760805位點T>A多態(tài)性，本結果與Wu等〔6〕和鞠亞菲等〔12〕學者的研究相一致，表明rs760805位點T>A多態(tài)性可能與亞洲人群胃癌易感性有關；而RUNX3基因rs11249206位點多態(tài)性則與已有研究結果不一致。Keller等〔13〕研究34例德國胃癌患者RUNX3基因突變與胃癌遺傳易感性的關系，發(fā)現(xiàn)無論是腸型還是彌散型胃癌均未發(fā)現(xiàn)基因突變。導致目前研究結果不一致的原因，可能是由于不同的種族、地域、生活環(huán)境以及研究樣本量偏小，今后尚需要增大樣本量深入研究。

Hp感染與胃癌發(fā)生的相關性目前已得到學術界公認，Hp感染與基因多態(tài)性的交互作用在胃癌發(fā)生中的研究已有大量報道。Jia等〔14〕報道Hp感染與基因多態(tài)性在胃癌發(fā)生中的相互作用，慢性炎癥增加了遺傳基因易感性，導致DNA損傷和基因異常甲基化促進胃癌發(fā)生。Hong等〔15〕報道攜帶IL-1β基因多態(tài)性的人群在Hp感染后更易發(fā)生胃癌，通過在癌前病變中的炎癥反應和低胃酸環(huán)境促進胃癌發(fā)生。He等〔16〕報道遺傳基因多態(tài)性與Hp感染發(fā)生交互作用致胃癌的過程中，依據(jù)Hp感染的狀態(tài)不同胃癌易感性有所不同。這些研究都表明胃癌發(fā)生過程中存在基因-環(huán)境交互作用模式。在胃癌高發(fā)區(qū)武威地區(qū)基因多態(tài)性與Hp感染在漢族人群胃癌高發(fā)的相關性也有研究。Zhang等〔17〕報道PARP-1基因多態(tài)性和Hp感染在甘肅威武地區(qū)胃癌發(fā)病風險中存在交互作用。Zhu等〔18〕也報道P53基因多態(tài)性和Hp感染在甘肅威武地區(qū)胃癌發(fā)病中也存在交互作用。本文結果表明遺傳和環(huán)境兩方面因素交互作用可能是甘肅威武地區(qū)胃癌高發(fā)的原因之一。

由于本研究樣本量較小，顯性基因的微效作用可能沒有被正確評估，而且rs760805和rs11249206位點也不可能代表RUNX3基因所有的功能性多態(tài)性位點，因此開展大樣本研究有可能更深入闡明RUNX3基因多態(tài)性在胃癌發(fā)生中的作用，Hp根除治療可能對武威地區(qū)胃癌高發(fā)起預防作用。RUNX3基因特異性位點變異可能成為該地區(qū)胃癌早期篩查的新靶標。

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〔2017-06-27修回〕

(編輯 曹夢園)

甘肅衛(wèi)生行業(yè)科研計劃管理項目資助(No.GWGL2010-17)

安黎哲(1963-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事分子生物學、生態(tài)學和環(huán)境植物學研究。

趙永勛(1977-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤外科學研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)14-3394-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.006

1 蘭州大學生命科學院 2 武威腫瘤醫(yī)院微創(chuàng)外科

3 武威市人民醫(yī)院肝膽外科