田洪星 殷少文

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

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花粉破壁率檢測(cè)方法研究進(jìn)展

田洪星 殷少文*

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

花粉破壁率的高低常被認(rèn)為是評(píng)價(jià)花粉破壁方法及破壁粉體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，但目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的花粉破壁率檢測(cè)方法。因此，探討了花粉破壁率不同的檢測(cè)方法，分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了存在的不足之處及發(fā)展趨勢(shì)，以期為花粉破壁率檢測(cè)方法深入研究奠定基礎(chǔ)。

花粉破壁率；檢測(cè)方法；研究進(jìn)度

花粉是植物的雄性配子體，存在于雄性花粉囊內(nèi)，是雄性花蕊上粉狀顆粒性細(xì)胞與蜜蜂的特殊分泌物所組成的復(fù)雜混合物[1]。研究證明，花粉不僅是植物的生命源泉，而且有“微型營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”之稱(內(nèi)含25%～30%蛋白質(zhì)、20多種易被人體吸收的游離氨基酸，10多種維生素、微量元素、天然活性酶及黃酮類物質(zhì))，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用[2-6]。

花粉外壁堅(jiān)硬主要由是由孢粉素、纖維素、角質(zhì)和花粉素等致密物質(zhì)所構(gòu)成，化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，具有耐酸、耐堿的特性，造成花粉壁內(nèi)的有效物質(zhì)浸出受到很大程度的阻礙，使得其有效物質(zhì)不能被人體充分利用[7]。為了提高花粉的利用價(jià)值，人們對(duì)花粉外壁做了諸多的探索，其中“花粉破壁技術(shù)”就是其中主要的研究方向之一。研究表明[8-9]，通過(guò)對(duì)花粉進(jìn)行破壁處理，可以提高花粉的利用率。目前花粉破壁方法主要有復(fù)合破壁法[8-9]、物理破壁法[10-11]、生化破壁法[12-13]等，但無(wú)論采用哪種破壁方法及工藝條件都應(yīng)有一個(gè)破壁率檢測(cè)方法，以檢驗(yàn)花粉的破壁程度。鑒于目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的花粉破壁率檢測(cè)方法，本文探討了花粉破壁率不同的檢測(cè)方法，分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了存在的不足之處及發(fā)展趨勢(shì)，擬為花粉破壁率檢測(cè)方法深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 顯微測(cè)定法

1.1 玻片直接計(jì)數(shù)法與改良組巴氏血球計(jì)數(shù)法 王華凱等[14]利用破壁前后的花粉能進(jìn)行定量的對(duì)比而求出百分率的方式對(duì)比分析了玻片直接計(jì)數(shù)法與改良組巴氏血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法。結(jié)果表明，玻片直接計(jì)數(shù)法簡(jiǎn)便易行，但因蓋玻片有擠壓作用，花粉細(xì)胞分布不易均勻，按視野計(jì)數(shù)，具有重疊或遺漏等缺點(diǎn)，且重現(xiàn)性較差。玻片直接計(jì)數(shù)法的測(cè)定方法是利用微量注射器( 或血色素吸管 )分別吸取已配制成等濃度的水溶液破壁花粉漿和未破壁花粉漿稀釋液10μL于普通載玻片上，加20mm×20mm蓋玻片，置顯微鏡下，移動(dòng)推進(jìn)器，在蓋玻片的中心位置，從左到右，從上到下，用高倍鏡逐個(gè)視野計(jì)數(shù)。測(cè)算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)×(對(duì)照品中花粉細(xì)胞數(shù)﹣檢品中留存的完整花粉細(xì)胞數(shù))/對(duì)照品中花粉細(xì)胞數(shù)×100%；

而改良組巴氏血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法則比玻片直接讀數(shù)法更為合理，因計(jì)數(shù)室有0.1 mm 深度，花粉細(xì)胞不受擠壓，四大格分布均勻，重現(xiàn)性好。且在沒有微量注射器的情況之下，也可用點(diǎn)眼棒沽取1小滴樣品于計(jì)數(shù)室內(nèi)，但充填要適度。該操作方法是由一厚玻片制成，整個(gè)計(jì)數(shù)室劃分為九大格。每大格面積為1mm2，其深度為0.1mm。 四角之四大格，每格劃分為16個(gè)中方格，分別吸取已配制成等濃度水溶液的破壁花粉漿和未破壁花粉漿稀釋液10μL，沿蓋玻片邊緣充入計(jì)數(shù)室，待3～5min，在高倍鏡下計(jì)數(shù)，將四角之四大格細(xì)胞總數(shù)÷4 即得每大格花粉細(xì)胞數(shù)。以每mm3，容積細(xì)胞數(shù)相比較，測(cè)算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)=100%﹣{100%×(A÷4×10)/(B÷4×10)}

試中：A 檢品的四大格總數(shù)；

B 對(duì)照品的四大格總數(shù)。

另外，通過(guò)改良組巴氏血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法對(duì)50余批花粉破壁率測(cè)定檢查，與玻片直接計(jì)數(shù)法測(cè)定方法相比較，該方法更具有快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，可作為今后檢測(cè)花粉破壁程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

1.2 染色法涂片法 該方法主要是在玻片直接計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，利用花粉經(jīng)染色后原生質(zhì)體呈淡紅色、壁為紫紅色，形成兩者反差大，花粉易于計(jì)數(shù)的原理進(jìn)行測(cè)定花粉的破壁率。薛妙男[15]通過(guò)用定量的堿性品紅染色液將破壁和未破壁的中國(guó)蜜源花粉分別染色1～1.5h，然后將染色后的花粉液稀釋5倍，攪勻后，用移液管取定量花粉液置載片上，涂抹展開于一定面積中，在40℃溫箱中烘干，用二甲苯透明2～3min，取出后用加拿大樹膠封片，然后進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)。光鏡下，配以目鏡測(cè)微尺，采用5點(diǎn)取樣法計(jì)算各點(diǎn)0.5cm2范圍內(nèi)的破壁及未破壁花粉數(shù)，按下列公式計(jì)算花粉的破壁率：

花粉破壁率(%)=100%×(破壁前完整花粉數(shù)﹣破壁后完整花粉數(shù))/破壁前完整花粉數(shù)；

由上可知，此法較玻片直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)法更為合理，顏色上的反差使得花粉易于計(jì)數(shù)，進(jìn)一步提供了顯微觀察結(jié)果的可靠性，然而也存在著玻片直接計(jì)數(shù)法中花粉分布不均勻，重疊或遺漏的現(xiàn)象，因此，該方法值得進(jìn)一步深入探討。

1.3 重量分析法配合顯微定量法 該法是在上述玻片直接計(jì)數(shù)法基礎(chǔ)之上，參考中藥顯微定量法，以完整花粉粒為參比物，用重量分析法配合顯微定量，測(cè)定花粉破壁率[16]。測(cè)算所得花粉破壁率(η)公式如下：

花粉破壁率(%)={1-(樣品花粉個(gè)數(shù)/對(duì)照花粉個(gè)數(shù))×(對(duì)照花粉重量/樣品花粉個(gè)數(shù))}×100%

樣品花粉個(gè)數(shù)為樣品花粉二次試樣9個(gè)視野觀察的總平均值；

對(duì)照花粉個(gè)數(shù)為對(duì)照花粉二次試樣9個(gè)視野觀察的總平均值；

對(duì)照花粉重量為配制混懸液時(shí)所稱對(duì)照花粉的實(shí)際重量(mg)；

樣品花粉重量為配制混懸液時(shí)所稱樣品的實(shí)際重量(mg)。

此法簡(jiǎn)便易行，采用水合氯醛試液進(jìn)行裝片，并在同1樣品2次混懸液觀察9個(gè)視野花粉粒的平均值，且相對(duì)偏差均小于5%。同時(shí)增加了重量法分析原理，使得測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度提高，更加可靠，但是原料必須為單一花粉，不得混有其它花粉及雜質(zhì)，否則易影響測(cè)量結(jié)果。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法原理是利用不同濃度的點(diǎn)來(lái)探討自變量和因變量之間的關(guān)系的一種定量分析方法。李英等[17]利用此原理摸索了松花粉破壁率與未破壁花粉細(xì)胞數(shù)的關(guān)系，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了影響測(cè)定的各種因素，得出了最佳試驗(yàn)條件。所得的方法曲線線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)便易行。 實(shí)驗(yàn)步驟首先是分別稱取未破壁松花粉對(duì)照品0g， 1.00g，5.00g， 10.00g、15.00g、 20.00g，用100%破壁松花粉稀釋至20.00 g混勻，制成破壁率分別為100%，95%，75%，50%，25%，0%的標(biāo)樣。分別稱取各標(biāo)樣0.50g，用水溶解并定容至25.00mL，制成20.00mg/mL的混懸液，然后再分別取經(jīng)振搖后的混懸液0.25mL于載玻片上，展開成面積約為5cm2的橢圓形薄片，在顯微鏡(目鏡×15、物鏡×10)下觀察，觀察5個(gè)視野，記錄每個(gè)視野內(nèi)未破壁花粉細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)樣平行操作3次，求出算術(shù)平均值。以破壁率為縱坐標(biāo)，以每個(gè)視野內(nèi)檢出未破壁花粉細(xì)胞數(shù)的算術(shù)平均值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品中檢出未破壁花粉細(xì)胞數(shù)，按照下公式，計(jì)算花粉破壁率：

Y= a+ bX

式中：Y松花粉的破壁率(%)；

X未破壁松花粉算術(shù)平均值(個(gè))；

a, b常數(shù)。

此法，適用于測(cè)定松花粉的破壁率，同時(shí)，也適應(yīng)于多種花粉破壁率的測(cè)定，且該法具有精密度、準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)便易行，線性范圍廣等特點(diǎn)。

2 激光粒度分析法

近年來(lái)，隨著中藥破壁率的研究發(fā)展，越來(lái)越多的科研學(xué)者已不再局限于傳統(tǒng)的顯微測(cè)定法進(jìn)行破壁率的研究，而是在不斷尋求新的破壁率測(cè)定方法。其中，激光粒度分析法就是比較具有前瞻性的分析方法，具有很大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)，不僅可以克服顯微測(cè)定法的主觀影響因素大的特性，而且還可以進(jìn)行中藥顯微特征不明顯的中藥材細(xì)胞破壁率的測(cè)定，另外，具有操作簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[18]。其原理主要是利用米氏散射理論，散射光的能量分布與顆粒直徑的分布直接相關(guān)，通過(guò)接受和測(cè)量散射光的能量分布就可以得出顆粒的粒度分布特征[19-20]。根據(jù)所測(cè)藥材的特性，可選擇濕法測(cè)定和干法測(cè)定。濕法測(cè)量是要先將樣品與某液體混合配制成懸浮液，并借助于攪拌、超聲波等物理?xiàng)l件進(jìn)行分散處理，使聚集顆粒分散為原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散狀態(tài)；干法測(cè)定用于測(cè)定水溶性或無(wú)合適分散介質(zhì)的固態(tài)試樣，通過(guò)由空壓機(jī)提供的高速氣流對(duì)團(tuán)聚的顆粒進(jìn)行沖擊分散，然后通過(guò)密閉空氣池進(jìn)行測(cè)量后被連接的真空吸塵器收集[21]。何煜等[22]首次探討了中藥細(xì)胞平均直徑、超微粉碎后的粒徑、細(xì)胞破壁率之間的關(guān)系，結(jié)果得出了理想的破碎模型計(jì)算法，破壁率公式(η)：

η1=[1-(1-1/n)3]×100%(n>1)；

η2=100%(n≤1)；

η=η1+η2；

其中，n為顆粒粒徑與細(xì)胞直徑之比。

在此基礎(chǔ)之上，楊瑛等[23]不僅建立了使用重量分析法配合顯微定量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蒲黃的細(xì)胞破壁率，同時(shí)探討了破壁率與粒徑值得關(guān)系，結(jié)果表明，細(xì)胞破壁率與粒徑值具有明顯的負(fù)相關(guān)性，隨著細(xì)胞破壁率的增大，粒徑值減小。此外，孫會(huì)麗等[24]分別以中藥顯微定量法及激光粒度分析法測(cè)定破壁率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)蒲黃超高壓撞擊流破壁處理進(jìn)行探討，優(yōu)選破壁最佳工藝；比較破壁前后蒲黃在顯微、粒度分布等方面的變化，兩種方法所測(cè)得破壁率結(jié)果基本一致?？芍?，激光粒度法用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)中藥顯微定量法測(cè)定蒲黃破壁率具有一定的可行性，同時(shí)，對(duì)于其它花粉破壁率激光粒度分析法研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。且該方法簡(jiǎn)便、快捷，具有客觀性的特性。

3 化學(xué)成分法

相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，破壁率與化學(xué)成分存在一定關(guān)系[18,24-26]，在此基礎(chǔ)之上，劉英梅等[27]探討了不同破壁率與不同破壁率花粉中脯氨酸含量的關(guān)系，提出了一種測(cè)定黑松花粉破壁率的新方法。利用分光光度法測(cè)出不同破壁率的樣品中脯氨酸含量在 520nm 處的吸光度后，按照下式計(jì)算松花粉的破壁率:

Y(%)=(a+bX)×100%

式中:Y：花粉的破壁率(%)；

X：樣品脯氨酸含量在 520nm 處的吸光度；

a、b： 為常數(shù)。

結(jié)果表明，花粉破壁率與其對(duì)應(yīng)的脯氨酸吸光度關(guān)系方程為y=11.886x-0.0637，R2= 0.9897。由此可見其線性關(guān)系良好，只要測(cè)出一種花粉破壁后的脯氨酸吸光度，代入方程，就可以得到其花粉破壁率，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可避免顯微測(cè)量破壁率所帶來(lái)的繁瑣操作過(guò)程。但存在一定的缺陷，不同的黑松花粉其內(nèi)在可利用到脯氨酸含量有所不同，測(cè)到的破壁率就有所不同，因此，影響結(jié)果的可靠性。

4 各種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)

縱觀目前花粉破壁率檢測(cè)方法，雖然每一種破壁率檢測(cè)方法都有自身的優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些不足之處見表1。

表1 各種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)

5 小結(jié)與展望

目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為天然花粉若不經(jīng)破殼處理，其有效成分便不能充分釋放，因此，花粉破壁率的高低便成為評(píng)價(jià)花粉破壁方法及花粉破壁粉體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。就目前文獻(xiàn)研究來(lái)看，花粉破壁率檢測(cè)方法主要有顯微測(cè)定法、激光粒度測(cè)定法以及化學(xué)成分測(cè)定法等方法，但是哪一種檢測(cè)方法才是比較合理的破壁率檢測(cè)方法，目前尚沒有統(tǒng)一的定論，通過(guò)表1各種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)，可見，每一種檢測(cè)方法均有一定的優(yōu)勢(shì)和缺陷，因此，何種檢測(cè)方法才是合理的，有待今后進(jìn)一步深入研究，但就筆者而言，激光粒度分析法可能是今后探討花粉破壁率研究一大熱點(diǎn)，有望成為一種合理標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法[24]。

另外，在分析或者研究何種花粉破壁率檢測(cè)方法更為合理時(shí)，首先要明確該檢測(cè)方法本身是否具有科學(xué)性，同時(shí)其檢驗(yàn)工藝是否存在一定的合理性，能否把產(chǎn)生誤差來(lái)源的因素降低到最小，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。比如，盧敬慈等[28]對(duì)靈芝孢子粉破壁率分析方法的測(cè)量不確定度評(píng)估及方法改良與優(yōu)化的思路，就給花粉破壁率分析方法不確定度的分析提供一個(gè)很好的例子。因此，在探討花粉破壁率檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)針對(duì)每種花粉的自身的特異性，對(duì)多種檢測(cè)方法作比較，相互驗(yàn)證，從而制定出合理的破壁率檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法。

基于上述各種論述，筆者提出了以下幾方面的建議，以期為今后制定合理的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考：加強(qiáng)破壁率檢測(cè)方法自身不確定度研究，以降低誤差來(lái)源因素，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；加強(qiáng)粒徑與花粉破壁率相關(guān)性研究以及影響因素的探討，以實(shí)現(xiàn)激光粒度分析法測(cè)定花粉破壁率，使檢測(cè)更為簡(jiǎn)便，操作易行，克服傳統(tǒng)顯微的不足之處；加強(qiáng)成分分析測(cè)定花粉破壁率研究，破壁率的高低某種程度上與花粉中化學(xué)成分成正比關(guān)系，但它們的相關(guān)性研究還缺乏深入研究；在測(cè)量某種花粉破壁率時(shí)，應(yīng)進(jìn)行多種檢測(cè)方法的系統(tǒng)研究或是多種方法聯(lián)合分析，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更合理與可靠。

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田洪星(1990-)，男，土家族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴帯⒚褡逅幮轮苿┘靶聞┬?。E-mail:846563439@qq.com

殷少文(1989-)，男，漢族，碩士，研究方向?yàn)槊褡逅庂|(zhì)量控制及新藥研發(fā)。E-mail:2488247271@qq.com

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1007-8517(2017)13-0052-04

2017-04-24 編輯：梁志慶)