初丕江 羅廷順* 王 姣

1.大理州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)，云南 大理 671000

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藥物研究

HPLC法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝寧片中5種活性成分的含量

初丕江1羅廷順1*王 姣2

1.大理州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)，云南 大理 671000

目的：建立同時(shí)測(cè)定護(hù)肝寧片中虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 等5種活性成分含量的HPLC法。方法：采用Waters Symmetry?C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%的磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，柱溫為40℃，流速為1.0mL/min。結(jié)果：5種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(r≥0.9996，n=6)，虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率均在92.6%～95.7%之間，RSD均在1.3～2.1%(n=9)之間。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確，靈敏，精密度好，重現(xiàn)性高，適用于護(hù)肝寧片中這5種活性成分含量的測(cè)定。

護(hù)肝寧片；高效液相色譜；含量測(cè)定；活性成分

護(hù)肝寧片是一種主要用于治療急慢性肝炎的中藥復(fù)方制劑，由垂盆草、虎杖、丹參、靈芝組成，具有清熱利濕退黃、疏肝化瘀止痛等功效，現(xiàn)代臨床常用于治療濕熱中阻、淤血阻絡(luò)所致脘腹脹痛、口苦、黃疸、胸悶、納呆以及急慢性肝炎[1]。槲皮素為垂盆草藥材的主要成分[2-3]，能改善患者惡心、納呆、上腹飽脹、乏力等癥狀，同時(shí)能保護(hù)肝臟，治療肝臟炎癥，其療效持久，且無明顯毒副作用[4]；虎杖苷和大黃素為虎杖藥材的主要成分，大黃素成分能顯助改善肝病變患者的病情，虎杖苷成分具有鎮(zhèn)咳，去痰、平喘、抗菌、清除自由基、調(diào)血脂、降低膽固醇之功效，可達(dá)到保護(hù)肝臟的作用[5]；丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA為丹參藥材的主要成分[6]，丹參中的丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA具有改善微物質(zhì)循環(huán)、疏通肝內(nèi)血液瘀滯、降低肝細(xì)胞纖維化程度、清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基、保護(hù)肝細(xì)胞等藥理作用[7]。黃麗華等[8]通過HPLC法測(cè)定護(hù)肝寧片中的大黃素，崔桂英[9]主要采用HPLC法測(cè)定護(hù)肝寧片中的丹參酮，陳波等[10]通HPLC法測(cè)定護(hù)肝寧片中的虎杖苷成分，馬果玉等[11]通過TLC定性鑒別丹參和虎杖，運(yùn)用HPLC定量分析虎杖中的虎杖苷成分。目前對(duì)處方中多指標(biāo)成分的同時(shí)定量分析研究甚少，且2015年版藥典[ 1]也僅針對(duì)處方中的某一指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)多指標(biāo)成分并未建立統(tǒng)一的定量分析方法。因此，本文旨在建立護(hù)肝寧片中多指標(biāo)成分的HPLC定量分析方法，提高護(hù)肝寧片的用藥安全性，為護(hù)肝寧片的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20 AT 型高效液相色譜儀(日本島津制作所)；AND GH-252電子天平(日本A&D公司)；SB-5200型雙頻超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2550型紫外分光光度儀(日本島津蘇州儀器有限公司)。

1.2 材料 虎杖苷(批號(hào)：111575-200502)、丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-200518)、丹參酮Ⅰ(批號(hào)：0867-200205)、大黃素(批號(hào)：110758-200110)、槲皮素(批號(hào)：100081-200907，96.5%)等均購(gòu)自中國(guó)食品藥品研究院。護(hù)肝寧片(批號(hào):20150902、20160802，貴州信邦制藥股份有限公司；批號(hào)：20150101，吉林百姓堂藥業(yè)有限公司)，乙腈(色譜純，批號(hào)：16065117，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(分析純，批號(hào)：10014118，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，批號(hào)：20160503，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 采用Waters C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如表1。檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL，流速為1.0mL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 精密稱取虎杖苷對(duì)照品13.72mg，大黃素對(duì)照品11.93mg，丹酚酸ⅡA對(duì)照品5.42mg，丹參酮Ⅰ對(duì)照品10.43mg，槲皮素對(duì)照品(含量：96.5%)21.56mg置于同一10mL容量瓶中加甲醇適量，超聲(功率250W，頻率40kHz)使溶解，加甲醇至刻度，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1mL至25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至既定刻度，制成含虎杖苷、大黃素、丹酚酸ⅡA、丹參酮Ⅰ、槲皮素對(duì)照品分別為54.88、47.72、21.68、41.72、83.22μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 護(hù)肝寧片(薄膜衣片)：取護(hù)肝寧片20片，研細(xì)，精密稱取0.5g于200mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲(功率250W，頻率40kHz)提取30min，冷卻，搖勻，濾過，作為供試品溶液待測(cè)；護(hù)肝寧片(糖衣片)，取護(hù)肝寧片10片，去除包衣，研細(xì)，精密稱取0.5g于25mL容量瓶中加75%乙醇適量，超聲(功率250W，頻率40kHz)提取30min，再加75%乙醇至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液，待測(cè)。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 去除垂盆草、虎杖、丹參、靈芝，按處方比例和制備工藝制備陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性考察 分別精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”項(xiàng)下溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，在該色譜條件下，虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹酚酸ⅡA 與其它相鄰成分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10200，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密移取上述混合對(duì)照品溶液10.0、2.5、5.0、5.0、2.0、2.0mL分別置10、20、25、50、100、200mL容量瓶中，加甲醇稀釋制成混合對(duì)照品系列濃度溶液，同時(shí)陰性樣品溶液和供試品溶液均按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見圖1。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x，μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的回歸方程。結(jié)果表明，這5種成分的線性關(guān)系良好。結(jié)果見表2。

2.3.3 定量限與檢測(cè)限 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.0mL置于200mL量瓶中，加甲醇稀釋成一定濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜方法分析。得信噪比為3和10時(shí)分別為虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA5種成分的檢測(cè)限與定量限。結(jié)果見表2。

表2 護(hù)肝寧片中5種成分的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，考察5種成分各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的一致性，結(jié)果各色譜峰的保留時(shí)間的RSD為0.3%～1.2%，峰面積RSD為0.5%～2.1%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)護(hù)肝寧片(貴州信邦制藥股份有限公司，批號(hào):20160802)0.5g，共6份，按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下分析條件分析，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 5種成分的平均含量分別為 12.97、23.37、0.9011、0.4047、0.08857mg/g，RSD分別為0.8%、1.1%、1.5%、1.1%、0.9%(n=6)。表明方法重復(fù)性良好，符合要求。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)護(hù)肝寧片(貴州信邦制藥股份有限公司，批號(hào):20160802)0.5g，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、32、48h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下分析條件測(cè)定5種成分的峰面積，結(jié)果虎杖苷、槲皮素、大黃素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 5種成分的峰面積的RSD分別為0.3%、1.0%、0.5%、0.7%、1.1%(n=7)。表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(虎杖苷12.97mg/g、槲皮素23.38mg/g、大黃素0.9072mg/g、丹參酮Ⅰ0.4039mg/g、丹參酮ⅡA 0.08871mg/g)的護(hù)肝寧片(批號(hào):20160802)0.25g，共9份，平均分為3組。分別精密加入3、2、1mL混合對(duì)照溶液(虎杖苷0.205mg/mL、大黃素0.0198mg/mL、丹參酮ⅡA 0.00202mg/mL、丹參酮Ⅰ0.00872mg/mL、槲皮素0.390mg/mL)。按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，按照 “2.1”項(xiàng)下分析方法進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

續(xù)表3 表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.8 含量測(cè)定 精密稱定護(hù)肝寧片0.5g，平行3份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，然后按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所得樣品含量見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g，n=3)

3 討論

供試品提取條件的優(yōu)化。主要考察提取溶劑和提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，分別考察了50%、90%、100%甲醇，50%、75%、95%乙醇6種提取溶劑，還考察了超聲(功率250W，頻率40kHz)提取的時(shí)間(20、30、40min)。最終得出護(hù)肝寧片最佳提取溶劑為75%乙醇溶液，超聲(功率250W，頻率40kHz)提取30min。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取稀釋至一定濃度混合對(duì)照品溶液，在紫外波長(zhǎng)為200～400nm范圍下掃描。測(cè)得虎杖苷在216.5、306nm波長(zhǎng)處有最大吸收，大黃素在217.5、253.5、290nm波長(zhǎng)處有最大吸收，槲皮素在255.5、371.5nm波長(zhǎng)處有最大吸收，丹參酮Ⅰ在244nm波長(zhǎng)處有最大吸收，丹參酮ⅡA在219.5、267.5nm波長(zhǎng)處有最大吸收。綜合考慮兼顧每個(gè)化合物，最終選定HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)護(hù)肝寧片中指標(biāo)成分的含量測(cè)定研究甚少，且大多僅針對(duì)其中的某一指標(biāo)成分進(jìn)行研究[12-17]。本文主要選擇護(hù)肝寧片中的5種成分(虎杖苷、大黃素、槲皮素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA)為指標(biāo)成分，在前人研究的基礎(chǔ)上，建立統(tǒng)一的HPLC含量測(cè)定方法。5種成分在相應(yīng)的響應(yīng)值范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r值均大于0.9996，平均加樣回收率為92.6%～95.7%，RSD為1.3%～2.1%。該方法精密度好、重現(xiàn)性高，適用于同時(shí)測(cè)定護(hù)肝寧片中這5種成分的含量，為護(hù)肝寧片的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

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Simultaneous Determination of 5 Active Compositions in Huganning Tablets by HPLC

CHU Pijiang1LUO Tingshun1*WANG Jiao2

1.Dali Institute For Food and Drug Control，Dali 671000，China;2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，China；

Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of Polydatin, quercetin, emodin, TanshinoneⅠ, TanshinoneⅡA in Huganning tablets.Methods The HPLC method uses the waters Symmetry?C18chromatographic column (250mm×4.6mm,5μm), with the mobile phases were acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was 270nm, the column temperature was 40℃.Results The calibration curves of five active compositions showed good linear relationship (r≥0.9996,n=6), the average recovery of Polydatin, quercetin, emodin, TanshinoneⅠ, TanshinoneⅡA five active compositions was within the range of 92.6%～95.7%，theRSDwithin the range of 1.3%～ 2.1%(n=9).Conclusion The method is sensitive and accurate with good reproducibility,and precision, which can be used to simultaneous detection the five active components in Huganning tablets.

Huganning Tablets；HPLC；Content Determination；Active Compositions

初丕江(1976 -)，女，白族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)檢測(cè)及方法學(xué)。 E-mail: 747183552@qq.com

羅廷順(1985-)，男，漢族，碩士，主管藥師，研究方向藥品檢驗(yàn)檢測(cè)及方法學(xué)。E-mail：309632602@qq.com

R284

A

1007-8517(2017)13-0008-05

2017-04-30 編輯：穆麗華)