1病原學(xué)

棘球?qū)伲‥chinococcus）在分類學(xué)上屬于動(dòng)物界，扁形動(dòng)物門，絳蟲綱，圓葉目，帶科，就全球范圍來說，目前已經(jīng)確認(rèn)的種類有細(xì)粒棘球絳蟲（E. granulosus）、多房棘球絳蟲（E. multilocularis）、石渠棘球絳蟲（E. shiquicus）、少節(jié)棘球絳蟲（E. oligarthra）、伏氏棘球絳蟲（E. vogeli）和其他從細(xì)粒棘球絳蟲種里面新分出來的種。

細(xì)粒棘球絳蟲種內(nèi)變異現(xiàn)象突出，最初根據(jù)線粒體cox1和nad1基因核苷酸序列的差異可將細(xì)粒棘球絳蟲分為10個(gè)基因型（G1～G10）以及獅株。在分子生物學(xué)方法廣泛使用之前，人們把細(xì)粒棘球絳蟲種內(nèi)的變異體稱為蟲株（strain）。雖然蟲株的概念在分類學(xué)屬非正式術(shù)語，但是它在實(shí)際工作中經(jīng)常被人們所采用。不同蟲株其形態(tài)學(xué)特征、宿主特異性、流行范圍、致病性等不盡相同。不同蟲株和基因型之間非常吻合，并且把G1～G10，再加上獅株統(tǒng)稱為細(xì)粒棘球絳蟲廣義種（E. granulosus sensu lato）。G1和G6的nad1基因核苷酸序列比較表明，差異性超過10%，差異明顯。根據(jù)線粒體基因組序列構(gòu)建的棘球?qū)俳{蟲分子種系系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）來看，公認(rèn)的種至少有9個(gè)，其中還有可能從加拿大棘球絳蟲（E. canadensis包括G6～G10）中再劃分出1～2新種，這是目前為止棘球?qū)俳{蟲最為完整的分類學(xué)情況。因此，有必要對(duì)棘球?qū)俳{蟲現(xiàn)有的分類地位進(jìn)行修正或修訂，即建議將細(xì)粒棘球絳蟲G1～G3（分別為普通綿羊株、塔斯馬尼亞綿羊株和水牛株）稱為細(xì)粒棘球絳蟲狹義種（E. granulosus sensu stricto），G4（馬株）新設(shè)為馬棘球絳蟲（E. equinus），G5（牛株）新設(shè)為奧氏棘球絳蟲（E. ortleppi），G6～G10（分別為駱駝株、豬株、鹿株、波蘭株和芬諾斯堪迪亞鹿株）新設(shè)為加拿大棘球絳蟲，獅株新設(shè)為貓或獅棘球絳蟲（E. felidis）[1-3]。

2診斷技術(shù)

2.1中間宿主———棘球蚴感染的診斷

主要是針對(duì)中間宿主———棘球絳蟲幼蟲的診斷。目前對(duì)患棘球蚴病的中間宿主的生前診斷尚無行之有效的方法，現(xiàn)普遍采用國(guó)際公認(rèn)的剖檢法，對(duì)家畜宰后進(jìn)行棘球蚴感染的調(diào)查，該法取得的調(diào)查結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)可疑病灶或包囊、一種宿主可感染多種棘球蚴等情況下有時(shí)無法做出準(zhǔn)確鑒定。生前診斷方法包括影像學(xué)（如X線透視/B超）和免疫學(xué)方法（如皮試、ELISA和IHA等血清學(xué)方法），其中影像學(xué)技術(shù)在篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或針對(duì)特別珍貴的動(dòng)物時(shí)才使用。剖檢法包括宰后肉眼觀察、實(shí)驗(yàn)室診斷（如鏡檢和PCR、RFLP-PCR、RPA等分子生物學(xué)方法）。

針對(duì)中間宿主棘球蚴感染的診斷，筆者所在的研究小組已分離篩選到棘球蚴囊液中極具應(yīng)用價(jià)值的抗原成分，并制備了相應(yīng)包蟲病檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)表明，試劑盒對(duì)200份經(jīng)剖檢和分子生物學(xué)確認(rèn)的包蟲病羊血清檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性檢出率為83%；檢測(cè)840份陰性羊血清時(shí)，陰性檢出率為97.2%。期望該試劑盒能用于羊棘球蚴感染的生前診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

2.2終末宿主———棘球絳蟲感染的診斷

主要是針對(duì)終末宿主（犬科動(dòng)物）———棘球絳蟲成蟲的診斷。生前診斷方法包括從小腸或糞便中查出成蟲、蟲卵與節(jié)片的顯微鏡檢測(cè)法和檳榔堿瀉下法（抽樣調(diào)查），以及糞DNA檢測(cè)法（LAMP、RPA、PCR等）、糞抗原ELISA法。剖檢法用于抽樣調(diào)查和作為評(píng)價(jià)其他方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)于終末宿主即犬科動(dòng)物的檢測(cè)，現(xiàn)在國(guó)際上仍普遍采用氫溴酸檳榔堿瀉法和剖檢法。糞抗原ELISA方法有其優(yōu)點(diǎn)與不足，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)簡(jiǎn)便，可以進(jìn)行批量檢測(cè)；不足之處是敏感性低，目前市面上的試劑盒只針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲（狹義種）的感染，而不能對(duì)多房棘球絳蟲感染進(jìn)行檢測(cè)或診斷，另外，對(duì)樣品新鮮度要求較高。

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物棘球蚴病診斷技術(shù)（修訂）》，增加了一些較為成熟的分子生物學(xué)方法與技術(shù)，例如PCR、PCR-RFLP、基因型分析等，為棘球絳蟲蟲種與蟲株（基因型）、可疑包囊的準(zhǔn)確鑒定、檢測(cè)或診斷等提供了新的工具。增加了終末宿主棘球絳蟲感染剖檢方法、糞便檢查方法、糞抗原檢測(cè)和糞DNA檢測(cè)等方法，為傳染源———犬等終末宿主流行病學(xué)調(diào)查與控制效果評(píng)價(jià)等提供了重要手段。

3流行病學(xué)調(diào)查

筆者開展了CE（囊型、單房型）流行病學(xué)調(diào)查和AE（泡型、多房型）流行病學(xué)調(diào)查。

3.1棘球蚴的宿主分布

細(xì)粒棘球絳蟲的終末宿主是犬、狼和豺等食肉動(dòng)物；中間宿主是羊、牛、駱駝、豬和鹿等偶蹄類動(dòng)物，偶可感染馬、袋鼠、某些嚙齒類、靈長(zhǎng)類和人。多房棘球蚴常見的終末宿主是狐，其次是狗、狼、獾和貓等。多房棘球蚴主要寄生在野生嚙齒類動(dòng)物如田鼠、麝鼠、旅鼠、倉(cāng)鼠、大沙鼠、小家鼠以及褐家鼠體內(nèi)。石渠棘球絳蟲的終末宿主是藏狐，中間宿主主要為高原鼠兔，到目前為止，還未在藏狐和高原鼠兔以外的動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有石渠棘球絳蟲（蚴）的寄生。

3.2廣義細(xì)粒棘球絳蟲在中國(guó)流行情況

G1分布廣泛，家畜和人均可以感染；少量G3、G6、G7、G10人體病例分布在四川、新疆、黑龍江等地。少量G3、G6、G10病例也存在于青藏高原的牦牛和綿羊中。

3.3野生動(dòng)物棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果

野生動(dòng)物多房棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果顯示，中間宿主為田鼠，久治縣的感染率為43.6%（41/94），達(dá)日縣的感染率為3.3%（5/151）。野生動(dòng)物石渠棘球蚴感染調(diào)查結(jié)果顯示，中間宿主為鼠兔，久治縣的感染率為7.5%（3/40），達(dá)日縣的感染率為14.3%（20/140）。某些區(qū)域野生動(dòng)物棘球蚴感染率超過10%，說明棘球蚴的流行嚴(yán)重，與這些區(qū)域人棘球蚴病感染率高相吻合，因此，野生動(dòng)物棘球蚴感染率可以作為人棘球蚴病感染狀況的一個(gè)生物指標(biāo)，或者說野生動(dòng)物可作為棘球蚴病流行病學(xué)調(diào)查的“哨兵”動(dòng)物而使用。endprint

3.4疫區(qū)犬糞樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)疫區(qū)犬糞樣品用LAMP進(jìn)行棘球絳蟲感染檢測(cè)，結(jié)果顯示：①?gòu)募?xì)粒棘球絳蟲感染檢測(cè)結(jié)果來看，達(dá)日縣的感染率為12.7%，久治縣的感染率為20.0%；②從多房棘球絳蟲感染檢測(cè)結(jié)果來看，達(dá)日縣的感染率為12.7%，久治縣的感染率為33.3%。

4防控技術(shù)

4.1切斷傳播途徑

切斷病原在犬—家畜之間的傳播鏈，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行驅(qū)蟲和使用疫苗免疫，禁止荷有包蟲的動(dòng)物臟器隨意拋棄和喂犬，在屠宰場(chǎng)實(shí)行嚴(yán)格檢疫制度，對(duì)廢棄臟器進(jìn)行無害化處理。

4.2疫苗技術(shù)與應(yīng)用

預(yù)防犬的棘球絳蟲感染疫苗研究尚處于初期階段，需要進(jìn)一步加大研發(fā)力度。預(yù)防羊和牛棘球蚴病的疫苗已取得突破性成就，并進(jìn)入推廣應(yīng)用階段。

4.3中國(guó)國(guó)家包蟲病免疫計(jì)劃

我國(guó)對(duì)包蟲病免疫計(jì)劃的進(jìn)程經(jīng)歷了以下幾個(gè)階段：①農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2014]10號(hào)），常見動(dòng)物疫病免疫推薦方案（試行）首次將包蟲病列為免疫病種之一；②農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2016]10號(hào)），國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃：在包蟲病重疫區(qū)，由省級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門會(huì)同有關(guān)部門根據(jù)監(jiān)測(cè)情況自主選擇免疫的策略；③農(nóng)業(yè)部文件（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017] 8號(hào)），國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃，在包蟲病流行區(qū)對(duì)新補(bǔ)欄羊進(jìn)行包蟲病免疫，群體免疫密度常年保持在90%以上，應(yīng)免疫動(dòng)物免疫一度達(dá)到100%。

5基因工程技術(shù)生產(chǎn)EG95重組抗原疫苗

基因工程技術(shù)生產(chǎn)EG95疫苗抗原的技術(shù)路線主要有兩種表達(dá)系統(tǒng)：①大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)；②畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。兩種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組抗原方面的比較如下：①現(xiàn)有的基因工程疫苗，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)EG95保護(hù)性抗原，產(chǎn)物為融合蛋白，呈包涵體形式表達(dá)，重組抗原不溶，需要復(fù)性，抗原難以維持天然蛋白構(gòu)像，無糖基化修飾作用，免疫效果較好，但目的蛋白不易純化，制苗工藝復(fù)雜；②正在研制的新型基因工程疫苗，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)EG95保護(hù)性抗原，產(chǎn)物呈分泌性表達(dá)，重組抗原可溶，抗原能維持天然蛋白構(gòu)象，有糖基化修飾作用，預(yù)期免疫效果更好，培養(yǎng)上清中蛋白表達(dá)量可達(dá)2g/L，目的蛋白純度在90%以上，無需純化，制苗工藝簡(jiǎn)單[3]。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，基因工程亞單位重組疫苗（EG95）在綿羊和牛進(jìn)行二免后可使免疫動(dòng)物產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的抵抗棘球蚴感染的保護(hù)力（80%以上），基因工程亞單位重組疫苗（EG95）已在中國(guó)、阿根廷等國(guó)家推廣使用。Gauci等[4]報(bào)道，小鼠試驗(yàn)證明，抵抗多房棘球蚴原發(fā)感染的免疫保護(hù)力為78.5%和82.9%。李建秋[5]對(duì)小鼠進(jìn)行His-EM95+常規(guī)免疫，結(jié)果表明抵抗多房棘球蚴繼發(fā)感染的免疫保護(hù)力為60.52%～67.38%。

6人用疫苗研發(fā)

包蟲病流行區(qū)約6，000萬人口受到被感染的危險(xiǎn)，數(shù)百萬人至近千萬人為高危人群，因此應(yīng)該考慮在高危人群使用疫苗進(jìn)行預(yù)防。疫苗需要符合人用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，通過篩選適宜佐劑、優(yōu)化EG95蛋白純化工藝和糖基化表達(dá)條件即可實(shí)現(xiàn)。研究EG95+EM95雙價(jià)疫苗最為理想。

7小結(jié)

科技部和衛(wèi)計(jì)委于2017年6月6日聯(lián)合下發(fā)了“十三五”重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目申報(bào)指南，其中把包蟲病人用疫苗的開發(fā)已列入研發(fā)內(nèi)容，這無疑對(duì)推動(dòng)棘球蚴病疫苗的深入研發(fā)注入了新活力。筆者所在研究小組的工作有幸得到了多個(gè)項(xiàng)目資金的大力支持，同時(shí)，特別感謝青海、寧夏、甘肅、新疆等省區(qū)動(dòng)物疫控部門、疾病控制部門、高校等同行對(duì)筆者工作的大力支持和幫助。筆者組織國(guó)內(nèi)包蟲病知名專家，共同協(xié)作，在2015年出版了《棘球蚴病》專著，把這些年來國(guó)內(nèi)外在包蟲病研究和防控工作中所取得的研究成果和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)歸納和總結(jié)，期望給包蟲病防控工作提供重要參考資料和強(qiáng)有力支撐。

參考文獻(xiàn)

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[5]Gauci C， Merli M， Muller V， et al. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with the larval stage of Echinococcus multilocularis[J]. Infection and Immunity， 2002， 70（7）： 3969-3972.

[6]李建秋.多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表達(dá)及應(yīng)用[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2015.endprint