徐文楊華瑜鄭永昌

（1. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科，北京 100730）

外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和剪接現(xiàn)象

徐文1楊華瑜2鄭永昌2

（1. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科，北京 100730）

外源性導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雙鏈DNA會(huì)經(jīng)歷重組、重排及其他復(fù)雜的分子生化反應(yīng)。極少數(shù)DNA分子會(huì)隨機(jī)整合到宿主基因組，即發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移。然而，目前還不清楚這些外源性DNA分子在不含有特殊啟動(dòng)子的情況下是否能被細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機(jī)器識(shí)別并起始轉(zhuǎn)錄。在構(gòu)建環(huán)狀RNA（circRNA）表達(dá)體系的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了外源性DNA分子能經(jīng)歷不依賴啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，而且轉(zhuǎn)錄本會(huì)發(fā)生符合“GU-AG”法則的RNA剪接進(jìn)而產(chǎn)生類似于環(huán)狀RNA的異常剪接分子。進(jìn)一步研究表明，外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和剪接現(xiàn)象是保守的。揭示了外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一個(gè)新的命運(yùn)途徑，該發(fā)現(xiàn)對(duì)研究外源性DNA對(duì)宿主細(xì)胞的影響具有重要意義及應(yīng)用價(jià)值。

不依賴啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；RNA剪接；circRNA；DNA轉(zhuǎn)染；選擇性剪接

早期研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入真核細(xì)胞的外源DNA分子可以發(fā)生重組、重排及其他復(fù)雜的分子生化反應(yīng)，可能形成長(zhǎng)達(dá)幾百kb的頭尾串聯(lián)結(jié)構(gòu)［1-7］。在哺乳動(dòng)物卵子和受精卵中微注射的DNA也能通過(guò)這種方式形成類似的高分子化合物結(jié)構(gòu)［8，9］。然而，對(duì)于這些DNA能否在缺乏功能性啟動(dòng)子下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及其后轉(zhuǎn)錄本的剪接缺乏尚不清楚。

根據(jù)報(bào)道，一類稱為coligo（Circular oligonucleotides，環(huán)狀寡核苷酸小體）的單鏈環(huán)狀DNA導(dǎo)入哺乳細(xì)胞后能被RNA聚合酶III識(shí)別并進(jìn)行不依賴于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生功能性RNA分子［10］。其后的研究表明，coligo的有效轉(zhuǎn)錄也需要相關(guān)序列和結(jié)構(gòu)的參與［11］。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的無(wú)啟動(dòng)子DNA上存在部分區(qū)域的異常轉(zhuǎn)錄峰，具體機(jī)制尚不明確，也可能是在轉(zhuǎn)錄測(cè)序過(guò)程中存在DNA污染［12］。

我們?cè)谘芯凯h(huán)狀RNA的生成過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)了不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄以及其后轉(zhuǎn)錄本的剪接現(xiàn)象。circRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類共價(jià)閉合的環(huán)狀非編碼RNA分子，其在細(xì)胞中的檢測(cè)主要使用反向引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR［13-15］。本研究以cirRNA在人細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)為出發(fā)點(diǎn)，借助RT-PCR和Northern blot等技術(shù)探究不依賴于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄和剪接現(xiàn)象，并對(duì)轉(zhuǎn)錄本的性質(zhì)作深入分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HEK 293T細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞來(lái)自于ATCC。

1.1.2 主要試劑 pGEMT、pGL和pcDNA3.1載體分別購(gòu)自Promega和Invitrogen生物公司。KOD-plus-突變?cè)噭┖匈?gòu)自TOYOBO。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX、RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III First-Strand Synthesis system、熒光定量PCR試劑盒SYBR Green以及ULTRAhyb-Oligo雜交液均購(gòu)自Life Technologies。引物合成和測(cè)序委托金唯智生物公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和抗生素為Gibco公司產(chǎn)品。所有酶制劑均來(lái)自于NEB。

1.2 方法

1.2.1 基因片段克隆 根據(jù)從NCBI網(wǎng)站獲得的不同基因片段序列信息以及文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)不同的引物對(duì)直接以少量細(xì)胞為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增［15］。所用引物對(duì)分別為zkscan1：5′-AACCAGTCTACATCACAATGTCTAA-3′，5′-AACCTAGAAAAGACTGAT-GCTATAGT-3′；ZNF608：5′-AAATGGGCTTTGTGTGTG-3′，5′-TCCTGCCCTTACTCCTCT-3′；CAMSAP1：5′-CGTCTTTA-GTGGGACAGCCGTT-3′；5′-AGCCAGCAGATGGAGCACC-3′；HIPK3：5′-GAAAGTCATTAACTTGTCTTTGTAATAT-3′；5′-GACCTAAAGAGTCACGGGAGC-3′；clec2d：5′-AGCTATCATCAGATTCACACCTCA-3′；5′-TCACATGACACTGCCTTTCATC-3′。PCR反應(yīng)條件均參照Q5 DNA聚合酶說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 載體構(gòu)建 上述片段按照常規(guī)TA克隆方法得到pGEMT系列載體。對(duì)于插入到pcDNA3.1的序列片段，使用5′端加入酶切位點(diǎn)的引物對(duì)PCR得到，引物對(duì)分別為pCDNA3.1_zkscan1：5′-ACTGggtacc-AACCAGTCTACATCACAATGTCTAA-3′，5′-ACTGgcg gccgcAACCTAGAAAAGACTGATGCTATAGT-3′；400-1882：5′-ATCGgatatcAAAGTGCTGAGATTACAGGCGT-3′，5′-ATCGgcggccgcTAATTTTCATATTTTTAGTAGAGACAAGG-3′。Zkscan1突變按照KOD-plus-突變?cè)噭┖械恼f(shuō)明進(jìn)行，使用的突變引物對(duì)為：5′-CAAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGG-3′和5′-CTCGTGACTGTAAGAGGC-3′。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞使用Lipofectamine LTX脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按常規(guī)方法轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在70%左右，六孔板每孔轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為2 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，使用Trizol提取細(xì)胞總RNA，并使用DNase I處理去除殘留的基因組DNA。反轉(zhuǎn)錄按SuperScript III First-Strand Synthesis system試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。RNA操作過(guò)程均在超凈臺(tái)中進(jìn)行，并使用無(wú)RNase的儀器設(shè)備操作。

1.2.4 qRT-PCR和半定量RT-PCR qRT-PCR按SYBR Green的反應(yīng)體系在Light Cycler480上進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，使用的引物對(duì)分別為GAPDH：5′-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′，5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′；zkscan1：5′-ATTCGTCTCGGAAACCCC-3′，5′-TCCCGTGATTCAGCAGTC-3′。半定量RT-PCR按照常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行，一般為22或24個(gè)循環(huán)取樣電泳，使用的引物對(duì)分別為GAPDH：5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，5′-TCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3′；zkscan1：5′-TCATGGACCTGAGATGCTCG-3′與5′-TACCATCCTTCTCCTGTGCA-3′或5′-AGTCCCACTTCAAACATTCGTCT-3′與 5′-CTGTTGTCCTGATAAATCAAGC-3′；ZNF608：5′-CGGTTGAACAGCTTTTGGTT-3′，5′-TGGATGAAGATGGGGAAAAG-3′；CAMSAP1：5′-TCAGTGCCTCGAAAGAACTTCCGT-3′，5′-TGTGCTCCTGCTCATACTGGTCAA-3′；HIPK3：5′-TATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCA-3′，5′-TGGTGGGTAGACCAAGACTTGTGA-3′；clec2d：5′-CACCCTTGGAAGTGGACAGA-3′，5′-TGCTCTGACGACTCTCTGTG-3′；G3PDH：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.5 RNase R敏感性分析 典型的反應(yīng)為20 μL總體系中加入2 μL RNase R 反應(yīng)緩沖液、10 μg總RNA以及0.5 μL的RNase R，37℃反應(yīng)2 h。對(duì)照組不加入RNase R，其他反應(yīng)條件不變。反應(yīng)結(jié)束后，取等體積（一般為1 μL）反應(yīng)體系立刻進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)。通過(guò)分別比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的GAPDH或靶基因的表達(dá)差異判斷其RNase R敏感性。

1.2.6 細(xì)胞藥物處理［10，16，17］將α-鵝膏蕈堿固體粉末溶于ddH2O中配置為1 mg/mL的母液，將ML-60218固定粉末溶于DMSO中配置為20 mmol/L母液；為了消除藥物對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，待轉(zhuǎn)染過(guò)程完成6 h后（此時(shí)轉(zhuǎn)染基本結(jié)束），將細(xì)胞換到含不同濃度藥物的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。體積不足的部分加ddH2O或DMSO補(bǔ)齊。

1.2.7 RNase H處理 15 μg 細(xì)胞總RNA與1 μg寡核苷酸探針混合于16 μL體系中，70℃孵育1 min后立刻置于冰上1 min以上，然后再加入2 μL 10×RNase H緩沖液混勻后，37℃孵育10 min，最后加入2 μL RNase H（5 U/μL），37℃孵育30 min。

1.2.8 Northern Blot 通過(guò)甲醛變形瓊脂糖凝膠電泳分離細(xì)胞總RNA后轉(zhuǎn)印至尼龍膜，紫外交聯(lián)后使用標(biāo)記好的放射性同位素雜交，通過(guò)ULTRAhyb-Oligo雜交液42℃預(yù)雜交30 min后加入標(biāo)記好的放射性探針42℃雜交過(guò)夜。寡核苷酸探針的放射性標(biāo)記總體系為20 μL，含2 μL32γ-ATP（10 mCi/mL），1 μL寡核苷酸（10 μmol/L），1 μL T4 PNK（10 U/μL），37度標(biāo)記1 h。使用50 mL洗膜液（2×SSC，0.5% SDS）42℃洗膜2-3次，最后將尼龍膜取出后用濾紙干燥，用保鮮膜包住放入含磷屏的暗夾中曝光12-24 h，通過(guò)Typhoon scanner掃描磷屏信號(hào)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［18］設(shè)計(jì)了合適的寡核苷酸探針，探針1：5′-GCGTTGGCGGAATATCTCTGGGTC-3′；探針 2：5′-TTTACTATTCCTCGTGACTG-3′；β-Actin：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

2 結(jié)果

2.1 外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄本剪接的現(xiàn)象

為了研究circRNA的生成機(jī)制，使用人zkscan1基因位置的環(huán)狀RNA作為研究對(duì)象。參與環(huán)化的外顯子以及其上下游約1 kb內(nèi)含子序列克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1中（pcDNA3.1_zkscan1，圖1-A）。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后，通過(guò)熒光定量PCR，可以檢測(cè)到豐富的反向剪接產(chǎn)物（圖1-B）。而在實(shí)驗(yàn)偶然轉(zhuǎn)染的原核克隆中間載體（pGEMT_zkscan1）中也能檢測(cè)到同樣豐富的產(chǎn)物（圖1-B）。

為了排除可能存在的真核表達(dá)元件，將zkscan1序列區(qū)域以正向（pGEMT_zkscan1_F）或反向（pGEMT_zkscan1_R）插入pGEMT載體后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，通過(guò)半定量RT-PCR均能檢測(cè)到“反向剪接產(chǎn)物”（圖1-C）。為了進(jìn)一步排除載體骨架序列的影響，只將覆蓋zkscan1區(qū)域的PCR片段轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后的結(jié)果（圖1-C）顯示，豐富的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物依然能被檢測(cè)到，說(shuō)明載體序列不參與轉(zhuǎn)錄。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些產(chǎn)物是否具有環(huán)狀構(gòu)型，通過(guò)RNase R（僅能降解線性RNA而不能降解環(huán)狀RNA的外切酶）處理轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒細(xì)胞的總RNA后進(jìn)行半定量RT-PCR（圖1-D）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1_zkscan1質(zhì)粒細(xì)胞中的反向剪接產(chǎn)物幾乎不受RNase R的影響，符合預(yù)期，而轉(zhuǎn)染了pGEMT_zkscan1載體細(xì)胞中的反向剪接產(chǎn)物幾乎完全被降解，說(shuō)明后者表達(dá)的大部分產(chǎn)物可能沒(méi)有環(huán)狀構(gòu)型。在本研究中，為了區(qū)別其與環(huán)狀RNA的反向剪接方式，稱這種特殊的剪接為“異常剪接”。

2.2 通過(guò)Northern blot分析不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

為了進(jìn)一步分析這些異常剪接產(chǎn)物，使用了兩個(gè)探針做Northern blot，探針1識(shí)別外顯子2，探針2設(shè)計(jì)在跨反向剪接位點(diǎn)上，前者能檢測(cè)到含有外顯子2的所有RNA分子，包括線性mRNA分子和環(huán)狀RNA，而后者只能檢測(cè)到由外顯子反向剪接產(chǎn)生的環(huán)狀RNA（圖2-A）。Northern blot結(jié)果（圖2-B）顯示，空載體不表達(dá)任何RNA分子，正對(duì)照400-1 882表達(dá)3種RNA分子。實(shí)驗(yàn)組中只有轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1_zkscan1質(zhì)粒的細(xì)胞才能檢測(cè)到相應(yīng)的RNA分子，而轉(zhuǎn)染了pGEMT_zkscan1或zkscan1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的組均不能檢測(cè)到明顯的條帶。推測(cè)這些特殊的RNA分子可能具有很長(zhǎng)的分子結(jié)構(gòu)，因此在瓊脂糖凝膠中積在膠孔附近難以轉(zhuǎn)膜。

圖1 外源zkscan1基因片段能進(jìn)行不依賴于啟動(dòng)子的異常轉(zhuǎn)錄

當(dāng)用探針1和RNase H水解轉(zhuǎn)染了zkscan1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后的細(xì)胞總RNA后，以探針2進(jìn)行Northern blot雜交可以檢測(cè)到明顯的條帶，而探針1檢測(cè)不到信號(hào)，反之亦然（圖2-C）。這些結(jié)果表明，這些異常的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物確實(shí)存在，而且極有可能具有串聯(lián)重復(fù)的長(zhǎng)分子結(jié)構(gòu)。

2.3 異常轉(zhuǎn)錄本的剪接依賴于細(xì)胞內(nèi)源的剪接信號(hào)

通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1_zkscan1、pGEMT_zkscan1及zkscan1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞總RNA發(fā)現(xiàn)，它們存在相同的擴(kuò)增圖譜，共產(chǎn)生3種剪接產(chǎn)物（圖4-A，WT）。而將下游內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的GU突變?yōu)镃A后，均發(fā)現(xiàn)了同樣的剪接條帶的上移（圖4-A，Mut）。Sanger測(cè)序顯示，這些不同條帶的產(chǎn)物均符合“GU-AG”法則，說(shuō)明異常轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生也是利用了同樣的細(xì)胞內(nèi)源剪接信號(hào)（圖4-B）。

2.4 RNA聚合酶II參與異常轉(zhuǎn)錄

利用真核生物RNA聚合酶對(duì)α- 鵝膏蕈堿和ML-60218的敏感性，研究這種不依賴于啟動(dòng)子的特殊轉(zhuǎn)錄是由哪一種RNA聚合酶負(fù)責(zé)合成。真核生物RNA聚合酶II對(duì)α-鵝膏蕈堿高度敏感，是RNA聚合酶III的敏感性的100倍。ML-60218是RNA聚合酶III的特異性抑制劑，抑制能力IC50為27 μmol/L，對(duì)其他兩種酶沒(méi)有抑制作用。如圖4-A顯示，當(dāng)α-鵝膏蕈堿的濃度為1 μg/mL時(shí)，只抑制RNA聚合酶II，幾乎不抑制RNA聚合酶III，不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄（pGEMT_zkscan1_異常剪接）被很大程度抑制，而且這種抑制效應(yīng)等同于RNA聚合酶II類型的啟動(dòng)子CMV起始的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（pcDNA_zkscan1_反向剪接）。與α-鵝膏蕈堿的有效抑制作用不同，高濃度的ML-60218（＞ 2倍IC50）則對(duì)兩種轉(zhuǎn)錄都沒(méi)有明顯的抑制作用（圖4-B）。推測(cè)RNA聚合酶II極有可能負(fù)責(zé)這種不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

2.5 不依賴于啟動(dòng)子的DNA轉(zhuǎn)錄和剪接在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是保守的

圖2 Northern blotting鑒定不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

圖3 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后對(duì)應(yīng)的反向/異常剪接產(chǎn)物的剪接模式

為了驗(yàn)證這種不依賴于啟動(dòng)子的DNA轉(zhuǎn)錄和剪接的保守性，從人基因組中克隆了產(chǎn)生環(huán)狀RNA的外顯子DNA區(qū)段以及其上下游部分內(nèi)含子序列（ZNF608，CAMSAP1，HIPK3）。分別在不同的PCR循環(huán)數(shù)時(shí)取5 μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。和內(nèi)源反向剪接產(chǎn)物需要在30-35個(gè)PCR循環(huán)數(shù)時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶相比，轉(zhuǎn)染外源DNA的異常剪接產(chǎn)物均能在18-22個(gè)PCR循環(huán)數(shù)時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖5-A），說(shuō)明它們均高效表達(dá)。

圖 4 RNA聚合酶II負(fù)責(zé)不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄

當(dāng)將pcDNA3.1_zkscan1和pGEMT_zkscan1載體導(dǎo)入小鼠NIH 3T3細(xì)胞后，半定量RT-PCR結(jié)果顯示前者的反向剪接以及后者的異常剪接現(xiàn)象均能觀察到。當(dāng)將一段小鼠基因片段（clec2d）按同樣的方法克隆轉(zhuǎn)入人293T細(xì)胞后，也能觀察到小鼠基因在人細(xì)胞中的異常剪接現(xiàn)象。這些結(jié)果表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不依賴于啟動(dòng)子的DNA轉(zhuǎn)錄和剪接是保守的。

圖5 不依賴啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與剪接沒(méi)有序列選擇性

3 討論

本研究證實(shí)了含外顯子的雙鏈DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后能被RNA聚合酶識(shí)別和有效轉(zhuǎn)錄。由于轉(zhuǎn)染的外源DNA分子整合到宿主基因組的概率極低（千分之一或更低），這些異常轉(zhuǎn)錄本很可能是來(lái)源于游離于染色體外的DNA分子的轉(zhuǎn)錄［5］。根據(jù)RNA聚合酶的抑制性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)RNA聚合酶II很有可能參與這種異常的轉(zhuǎn)錄。一般情況下，RNA聚合酶II通過(guò)識(shí)別特殊的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行下游DNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)源的基因組DNA大多以染色質(zhì)形式存在，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的DNA修飾或結(jié)合多種組蛋白［19，20］。而導(dǎo)入細(xì)胞的雙鏈DNA是提取自原核生物的質(zhì)?；蛲ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增的片段，均處于裸露狀態(tài)，RNA聚合酶更容易結(jié)合。本研究的發(fā)現(xiàn)證明，細(xì)胞從外源獲取的DNA分子除了通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生影響，還有可能在RNA水平對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生更直接的影響。

同時(shí)，本研究還對(duì)環(huán)狀RNA的表達(dá)分析有重要發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)反向引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)到的分子并不一定是以環(huán)狀構(gòu)型存在，還需要進(jìn)行RNase R的進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究使用真核表達(dá)載體構(gòu)建了環(huán)狀RNA的表達(dá)體系，并發(fā)現(xiàn)了外源DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不依賴于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄本的剪接現(xiàn)象；證明了這種現(xiàn)象在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是保守的。該研究對(duì)環(huán)狀RNA的表達(dá)分析具有重要的借鑒作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Promoter-independent Transcription of Exogenous DNA and Subsequent RNA Splicing in Mammalian Cells

XU Wen1YANG Hua-yu2ZHENG Yong-chang2
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2. Department of Liver Surgery，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730）

Introduction of exogenous double stranded DNA into mammalian cells will undergo restructuring，rearrangement and other complex molecular and biochemical reaction. Few DNA molecules will randomly integrate into the host genome，namely the occurrence of horizontal gene transfer. However，it is unclear whether these exogenous DNA molecules can be recognized by cell machine and triggers the transcription in the circumstance of containing no special promoter. During the construction of circle RNA（circRNA）expression system，we discovered that promoter-independent transcription of exogenous DNA occurred，also RNA splicing was in accord with “GU-AG” in transcripts，and subsequently abnormal spliced molecules similar to the circRNA formed. Further studies showed that the promoter-independent transcription and splicing of exogenous DNA in mammalian cells were conservative. Conclusively，this work revealed a new destiny approach of exogenous DNA in the mammalian cells，which is of significance and applicability in studying the effects of exogenous DNA on host cells.

promoter-independent transcription；RNA splicing；circRNA；DNA transfection；alternative splicing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0183

2017-03-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2015AA020303）

徐文，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：xuwenhbnu@163.com

鄭永昌，男，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽腫瘤分子生物學(xué)；E-mail：zyc_pumc@163.com