徐雯瞿印權(quán)韓笑何天友榮俊冬鄭郁善

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)學(xué)院園林學(xué)院，福州 350002）

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化綠竹ISSR-PCR體系和引物篩選

徐雯1瞿印權(quán)1韓笑1何天友2榮俊冬1鄭郁善1

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)學(xué)院園林學(xué)院，福州 350002）

旨在建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，并篩選適于綠竹ISSR-PCR分析的高多態(tài)性引物。以綠竹基因組DNA為ISSR-PCR擴(kuò)增模板，采用正交試驗(yàn)方法，對(duì)dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、模板DNA用量設(shè)計(jì)5因素4水平試驗(yàn)，采用極差分析法和方差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。并對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。并利用優(yōu)化后的體系對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選。最終確定的最佳反應(yīng)體系為：20 μL的擴(kuò)增體系中，dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng，10×PCR Buffer體積為2 μL、剩下用滅菌ddH2O補(bǔ)全。各因素影響大小依次是：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)38次，72℃延伸10 min，4℃保存。以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。

綠竹；ISSR；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；反應(yīng)體系；擴(kuò)增程序；引物篩選

綠竹（Dendrocalamopsis oldhami（Munro））屬禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）綠竹屬（Dendrocalamopsis）叢生竹種，是綠竹屬中分布最廣、栽培最多的竹種［1］。綠竹具有發(fā)筍期長(zhǎng)、生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量豐富、筍味鮮美，質(zhì)地柔軟的優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)南方優(yōu)良速生的筍材兩用叢生竹種之一，具有較高的商品效益，是主產(chǎn)地的經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一［2］。綠竹原產(chǎn)我國(guó)臺(tái)灣省淡水，我國(guó)主要分布在浙江南部、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西和海南等省區(qū)［3］。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于綠竹的研究報(bào)道，主要集中在良種繁育技術(shù)研究、生物量研究、生理特性研究，蛋白組學(xué)研究等方面［4-10］，而關(guān)于分子遺傳學(xué)研究［11-13］較少，且綠竹分子標(biāo)記的研究中主要是運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)，余學(xué)軍等［11］利用RAPD標(biāo)記對(duì)22個(gè)不同栽培類型的綠竹進(jìn)行多態(tài)性分析。吳益民等［12］構(gòu)建孝順竹、鳳尾竹、綠竹、白綠竹4個(gè)竹種RAPD指紋圖譜。但是RAPD在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易產(chǎn)生假帶、共遷移等現(xiàn)象，所以結(jié)果不夠穩(wěn)定，重復(fù)性較低。簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（Inter simpce sequence repeat，ISSR）技術(shù)是1994年Zietkiewicz等［14］在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子標(biāo)記方法，具有簡(jiǎn)單快捷易操作，DNA用量較少，試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，由于其多態(tài)性好、穩(wěn)定性高和重復(fù)性高的特性被廣泛應(yīng)用于多種物種的品種鑒定和遺傳多樣性分析等方面［15，16］。而利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)綠竹ISSR-PCR體系建立尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設(shè)計(jì)5因素4水平試驗(yàn)，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，并優(yōu)化擴(kuò)增程序、篩選出高多態(tài)性引物，旨在為綠竹的種質(zhì)資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、分子育種、DNA指紋圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的材料于2016年8月采自于福建省東山國(guó)有赤山林場(chǎng)的綠竹地理種源試驗(yàn)樣地。對(duì)不同的植株隨機(jī)選取3-5片嫩葉，放置于塑料自封袋中，并用變色硅膠進(jìn)行迅速干燥，將干燥的材料速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 綠竹基因組總DNA的提取與檢測(cè) 綠竹總DNA的提取采用的是杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（Cat＃BSC13S1）法，并對(duì)該種方法略作改良。提取完后用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性與清晰性，看是否有降解或斷裂現(xiàn)象，將滿足試驗(yàn)條件的DNA稀釋到20 ng/μL，并置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化 用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設(shè)計(jì)5因素4水平試驗(yàn)（表1），共16個(gè)處理，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，來(lái)研究各因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響。反應(yīng)體系的總體積為20 μL，引物選擇UBC815。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，4℃保存。

將PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上，電泳45 min，電壓設(shè)為5 v/cm。并用紫外凝膠成像分析儀拍照記錄電泳情況。利用直觀分析法對(duì)每個(gè)處理結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，一共劃分為16個(gè)等級(jí)，以條帶的清晰度、明亮度、特異性高低為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，最高的記為16分，最低的記為1分［17］。評(píng)分結(jié)果用DPS7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

1.2.3 綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序的優(yōu)化 在最優(yōu)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)的方法對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選，根據(jù)引物U815的Tm值52.9℃，在45-60℃之間設(shè)置了12個(gè)溫度梯度，系統(tǒng)自動(dòng)生成的12個(gè)溫度梯度分別為44.9℃，45.2℃，46.1℃，47.5℃，49.3℃，51.2℃，53.3℃，55.2℃，57.1℃，58.5℃，59.6℃，60.1℃。對(duì)循環(huán)次數(shù)設(shè)置了30次、32次、35次、38次、40次5個(gè)梯度，以篩選出最佳的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序。

1.2.4 綠竹ISSR擴(kuò)增體系穩(wěn)定性驗(yàn)證 以不同種源的綠竹的基因組總DNA為模板，在最佳反應(yīng)體系和最佳擴(kuò)增程序下，用引物 UBC815進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)建立的擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性。

1.2.5 ISSR有效引物的篩選 以優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)的因素水平L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 綠竹基因組總DNA的提取結(jié)果

部分綠竹基因組總DNA凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，我們可以看出DNA條帶清晰明亮，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明所提取的DNA基因組完整性較好，無(wú)明顯降解現(xiàn)象。利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說(shuō)明DNA的純度較高。

圖1 綠竹基因組DNA電泳圖

2.2 綠竹ISSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果

綠竹正交試驗(yàn)的電泳結(jié)果如圖2所示，在16個(gè)處理組合中，由于dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA濃度5個(gè)影響因素各水平組合的不同，擴(kuò)增結(jié)果存在明顯的差異。對(duì)正交試驗(yàn)的各處理的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)評(píng)分計(jì)算每個(gè)因素同一水平下的總和T和平均值X，以及極差R，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

極差R值越大，說(shuō)明該因素對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響越大。由表2可知，各因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞ 模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶 ＞ 引物。平均值X最大值所對(duì)應(yīng)的水平即為該因素的最佳濃度。所以dNTPs水平3、Mg2+水平1、Taq DNA聚合酶水平3、引物水平2、模板DNA水平4最好。因此綠竹ISSR-PCR正交試驗(yàn)得出的最佳水平為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.5 μmol/L，DNA濃度為為60 ng。

為了進(jìn)一步判斷各個(gè)因素對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增影響的顯著程度，對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。其中F值越大，說(shuō)明該因素對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響越大。由表3可知，各因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。與極差分析的結(jié)果一致。其中dNTPs、Mg2+和模板DNA對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增影響達(dá)到極顯著的水平（P＜0.01）。Taq DNA聚合酶對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增影響達(dá)到顯著的水平（P＜0.05）。引物濃度對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增影響不顯著。

為了進(jìn)一步確定每個(gè)因素的最適宜的濃度水平，對(duì)5個(gè)因素進(jìn)行Duncan多重比較，結(jié)果見(jiàn)表4。由之前的極差分析和方差分析可知，dNTPs對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響僅次于Mg2+，從多重比較可以看出，dNTPs水平1、水平2、水平3和水平4差異顯著，而水平1、水平2、水平3之間的差異并不顯著，從經(jīng)濟(jì)角度最終選擇dNTPs最佳濃度為0.2 mmol/L。Mg2+對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響最大，Mg2+水平1、水平2和水平3、水平4差異顯著，水平1和水平2兩者差異不顯著，綜合而言，最終選擇Mg2+最佳濃度為2.0 mmol/L。當(dāng)TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U時(shí)，極差分析的均值最大，且與其他3個(gè)水平差異顯著，所以最終選擇TaqDNA聚合酶最佳濃度為1.5 U。在本試驗(yàn)中，引物濃度對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響最小，且4個(gè)水平間差異不顯著，從經(jīng)濟(jì)角度最終選擇引物最佳濃度為0.4 μmol/L。當(dāng)模板DNA濃度為60 ng，極差分析的均值最大，且與其他3個(gè)水平差異顯著，所以最終選模板DNA最佳用量為60 ng。

綜上所述，最終確定的綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體積為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng。

圖2 正交設(shè)計(jì)ISSR-PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

表3 ISSR-PCR反應(yīng)各因素方差分析

表4 ISSR-PCR各因素水平間Duncan多重比較

圖3 循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR的影響

圖4 退火溫度對(duì)ISSR-PCR的影響

2.3 綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序的優(yōu)化結(jié)果

不同的循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)循環(huán)次數(shù)設(shè)置了30次、32次、35次、38次和40次5個(gè)梯度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰明亮且穩(wěn)定。所以，選擇38次循環(huán)為ISSR-PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)次數(shù)。

不同的退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增也有一定的影響。根據(jù)引物U815的Tm值52.9℃，在45-60℃之間設(shè)置了12個(gè)溫度梯度，結(jié)果（圖4）顯示退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響明顯，當(dāng)退火溫度為47.5℃時(shí)，擴(kuò)增的條帶數(shù)最為清晰穩(wěn)定，當(dāng)退火溫度大于47.5℃時(shí)，高分子量區(qū)域和中等分子量區(qū)域條帶的擴(kuò)增效率下降，直至無(wú)擴(kuò)增條帶，且在低分子量區(qū)域也逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，整體電泳條帶數(shù)逐漸減少，清晰度也逐漸減弱，因此，最終確定引物U815的最佳退火溫度為47.5℃。

2.4 綠竹ISSR擴(kuò)增體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

利用引物UBC818對(duì)不同種源的綠竹個(gè)體的基因組總DNA樣品進(jìn)行進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，在該體系下均能擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定，多態(tài)性豐富的條帶。說(shuō)明該體系穩(wěn)定可靠，適合綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖5 不同種源的綠竹個(gè)體擴(kuò)增結(jié)果

圖6 ISSR有效引物的篩選

表5 供篩選引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)

2.5 ISSR有效引物的篩選

根據(jù)綠竹優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，對(duì)100條隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增。部分引物篩選結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示利用建立的體系篩選不同的引物時(shí)，大部分引物都能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，只有少部分引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)較少或不能擴(kuò)增出條帶。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的綠竹最佳反應(yīng)體系具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。最終在100條引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰不拖尾，穩(wěn)定性較好的引物（表5）。

3 討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、指紋圖譜的構(gòu)建等方面的研究，是目前使用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一［18-20］。ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果受到物種類型、反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序、引物等的綜合影響。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、模板DNA用量設(shè)計(jì)5因素4水平試驗(yàn)，并對(duì)擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，利用優(yōu)化后的體系對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以克服單因素試驗(yàn)不能考慮到各影響因素之間的相互作用的缺點(diǎn)，還可以解決完全組合設(shè)計(jì)需要大量試驗(yàn)、耗時(shí)耗費(fèi)的不足，具有設(shè)計(jì)均衡分散、齊整可比、效應(yīng)明顯、節(jié)約時(shí)間和成本等優(yōu)點(diǎn)［17］，能夠通過(guò)較少的處理組合快速找到最佳的ISSR-PCR反應(yīng)體系，并能分析出不同因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響的顯著性。但是正交試驗(yàn)直觀分析又有一定的主觀隨機(jī)性，所以需要設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)來(lái)減少打分誤差，增加數(shù)據(jù)的可靠性［21］。

在本實(shí)驗(yàn)中，不同的處理組合對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響差異明顯。極差分析和方差分析的結(jié)果均表明各因素對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。Mg2+是影響綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增最顯著的因素，Mg2+濃度變化直接影響Taq DNA聚合酶的活性，并間接影響引物與模板DNA的雙聯(lián)雜交體的解鏈溫度、引物的退火溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的生成［22-23］。靳曉麗等［24-26］研究均顯示Mg2+對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增影響最大，所以正確的把握好Mg2+的用量很關(guān)鍵。dNTPs對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響僅次于Mg2+，dNTPs是PCR擴(kuò)增的底物，dNTPs濃度過(guò)低會(huì)降低DNA的合成速率，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量的下降；dNTPs濃度過(guò)高又會(huì)與Mg2+相鰲合從而間接影響Taq DNA聚合酶的活性，導(dǎo)致堿基的錯(cuò)誤滲入和非特異性擴(kuò)增［27，28］。模板DNA濃度對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響也是極顯著的，在本實(shí)驗(yàn)中DNA模板濃度越高，擴(kuò)增的條帶越亮產(chǎn)量越多。Taq DNA聚合酶對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響是顯著的，Taq DNA聚合酶濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率較低，條帶較弱；濃度過(guò)高又會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶［29］。在本實(shí)驗(yàn)中引物濃度對(duì)綠竹ISSRPCR擴(kuò)增的影響不顯著，這可能與本實(shí)驗(yàn)中引物濃度設(shè)置的水平范圍有關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中，引物濃度在0.4-0.7 μmol/L之間設(shè)置了4個(gè)水平，4個(gè)水平間差異不顯著，與包蕊等［30］研究的在ISSR-PCR反應(yīng)中引物濃度影響最小的研究結(jié)果一致。

循環(huán)次數(shù)和退火溫度對(duì)綠竹ISSR-PCR 擴(kuò)增也有一定影響，循環(huán)次數(shù)較少，擴(kuò)增的條帶數(shù)也較少且清晰度較低；循環(huán)次數(shù)過(guò)多又會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。退火溫度較低會(huì)導(dǎo)致模板DNA與引物的非特異性結(jié)合且背景深；退火溫度較高又會(huì)使得模板DNA與引物的結(jié)合率下降，從而使得擴(kuò)增出來(lái)的條帶數(shù)較少［31］。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著退火溫度的增加，擴(kuò)增出的產(chǎn)物的特異性越好，一般最佳的退火溫度低于引物的真實(shí)Tm值5℃左右［32］。

4 結(jié)論

本研究采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設(shè)計(jì)5因素4水平試驗(yàn)，并通過(guò)直觀分析和正交極差分析對(duì)比，確定了這5個(gè)因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響力大小以及最佳用量。最后確定適合綠竹ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該體系穩(wěn)定可靠，適合于綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System on Dendrocalamus oldhami by Orthogonal Design，and Selection of Primer

XU Wen1QU Yin-quan1HAN Xiao1HE Tian-you2RONG Jun-dong1ZHENG Yu-shan1
（1. College of forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；2. College of Art & Landscape Architecture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

This work is to establish the optimal ISSR-PCR reaction system and amplifying procedure，and to screen high polymorphism primers for ISSR-PCR analysis of Dendrocalamus oldhami（Munro）. First，the genomic DNA extracted from D. oldhami（Munro）was used as template for ISSR-PCR amplification，and the orthogonal design（L16（45））was to investigate the optimal concentrations of dNTPs，Mg2+，Taq DNA polymerase，primers and DNA template，and the results were analyzed by range and variance analysis method. Then，the annealing temperature and the number of cycles were screened for establishing the optimal D. oldhami（Munro）ISSR-PCR reaction system and amplifying procedure. Moreover，the optimized system was utilized to screen the 100 ISSR primers. Ultimately，the optimal reaction system was determined as follows：in 20 μL reaction system containing 0.2 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L Mg2+，1.5U Taq DNA polymerase，0.4 μmol/ L primer，60 ng DNA template，2.0 μL 10×Taq Buffer，and ddH2O completed. The order of the effect by the factors was in Mg2+＞ dNTPs ＞DNA template ＞ Taq DNA polymerase ＞ primer. The optimal amplifying procedure was as follows：pre-denaturing for 5 min at 94℃，38 cycles were performed with denaturing of 45 s at 94℃，annealing of 30 s due to denaturing temperature of different primer，extension of 90 s at 72℃，a final extension step of 10 min at 72℃ and stored at 4℃. Using this optimized PCR system，14 of 100 primers was selected for their clarity，high polymorphism and repetition.

Dendrocalamus oldhami（Munro）；ISSR；orthogonal design；reaction system；amplifying procedure；primer screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170004

2017-01-11

福建省農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目（2013N0002），福建省農(nóng)業(yè)科技重大項(xiàng)目（2011N5002）

徐雯，女，碩士研究生，研究方向：森林培育理論與技術(shù)；E-mail：1243051350@qq.com

鄭郁善，男，教授，博導(dǎo)，研究方向：森林培育與園林植物栽培；E-mail：zys1960@ 163.com