陳哲 黃靜 趙佳 梁宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

番茄灰霉病病原菌分離鑒定及拮抗菌篩選

陳哲 黃靜 趙佳 梁宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)上的重要病害。從番茄果實表面成功分離了1株真菌BC2016-2，經(jīng)過鑒定確定其為灰霉病的病原菌——灰葡萄孢菌；以灰葡萄孢菌BC2016-2為指示菌，篩選到了3株具有明顯抑制作用的菌株，分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）CM3、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）Y-30和解淀粉芽孢桿菌Y-48。盆栽實驗結(jié)果顯示，菌株CM3、Y-30和Y-48對灰葡萄孢菌BC2016-2引起的番茄灰霉病的防治效果分別為65.58%、54.1%和72.13%。

灰葡萄孢菌；解淀粉芽孢桿菌；巨大芽孢桿菌；生物防治

番茄，是茄科番茄屬一年生或多年生草本植物，用途非常廣泛，可食用，可烹飪，還能加工番茄醬、汁等，因而在我國南北方廣泛栽培。由于目前番茄大多采用溫室設(shè)施種植，而溫室內(nèi)的小氣候環(huán)境一般濕度較高，且冬春季節(jié)平均溫度也高于室外，很容易滋生病害，其中灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引發(fā)的灰霉病就是一種較為常見的病害?；移咸焰呔前胫鷣嗛T絲孢綱絲孢目淡色菌科葡萄孢屬弱寄生病原菌，其寄主范圍相當廣泛，能夠侵染近200多種植物，尤其在冬春季節(jié)的溫室大棚中，特別容易感染瓜類、漿果類和茄果類等果蔬作物，成為限制其品質(zhì)和產(chǎn)量提高的重要因素［1］。

番茄的葉片、莖和果實都會受到灰葡萄孢菌的侵染，一旦感染葉片和莖部會出現(xiàn)水漬狀病斑，感染的前期莖葉組織會軟化，后期則腐爛，果實被感染后會在表面形成灰色霉層，慢慢變軟腐爛，極大影響了番茄產(chǎn)量，嚴重時減產(chǎn)可達20%-30% 以上。番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)和儲藏中的主要病害之一，目前主要依靠化學(xué)殺菌劑來防治番茄灰霉病。但長期使用化學(xué)殺菌劑容易造成病原菌的抗藥性及食品安全問題，因而微生物防治是重要的研究方向［2］。

目前報道過的灰霉病生防菌包括芽孢桿菌（Bacillus）［3-4］、假單胞菌（Pseudomonas）［5］、木霉菌（Trichoderma）［6］、鏈霉菌（Streptomyces）［7］和酵母菌（Yeast）［8］等，其生防機制包括競爭作用、拮抗作用、重寄生作用、溶菌作用、誘導(dǎo)抗性及促進植物生長等方面［9］。隨著生防菌的不斷使用，生物防治已成為控制番茄灰霉病的一條重要而有效的途徑，具有良好的應(yīng)用前景［10］。

本研究針對當?shù)販厥页Ｒ姷幕颐共?，從發(fā)病的番茄果實中分離病原菌灰葡萄孢菌，并分離篩選出對其有抑制作用的菌株，旨為番茄灰霉病的防治奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄灰霉病病樣采自榆次東陽鎮(zhèn)實驗基地大棚，番茄品種為“齊達利”。

培養(yǎng)基：PDA瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15-20 g，自來水1 000 mL，自然pH；PDB液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其它成分同 PDA 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離和純化 菌株的分離純化參照常規(guī)方法［11-12］。將帶有明顯的灰霉病病癥的番茄果實表面用10%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min后，用無菌水沖洗3 次，切取病健交界處組織塊若干，分別接種到PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。22℃培養(yǎng)1-2 d后，挑選與灰葡萄孢菌形態(tài)相似的單菌落，接到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到菌落表現(xiàn)均勻一致為止。將純化后的菌株標記為“BC2016-2” 且接種到PDA 斜面培養(yǎng)基上，22℃下培養(yǎng)3 d后放到4℃冰箱保藏以備長期使用。為了保證病原菌存活，維持其致病力，每90 d在PDA培養(yǎng)基上繼代1次。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，22℃倒置培養(yǎng)。參照魏景超［11］對培養(yǎng)特征、形態(tài)特征進行觀察并記錄，以確定該菌株的種屬地位。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 將純化后的單克隆菌落送至上海生工進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，用Mega 6.0軟件分析序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 病原菌的拮抗菌株篩選 采用平板對峙法。用打孔器取活化的病原菌菌餅（直徑為6 mm）置于PDA 平板中央，22℃培養(yǎng)24 h；用滅菌的牙簽挑取純化好的菌種點接在距平皿中心 3 cm 處的 4 個角點上，30℃培養(yǎng)3-5 d。每處理設(shè)3個重復(fù)，以只接種病原菌的平板作對照，觀察病原菌的生長狀態(tài)，選出對病原菌生長有抑制作用，且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株，測量病原菌菌落直徑，計算菌株的抑制率。

1.2.5 拮抗菌的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)特征觀察 拮抗菌株的形態(tài)特征分析參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］。

1.2.5.2 16S rDNA 序列分析 將純化后的單克隆菌株送至上海生工測序，測序后獲得的 16S rDNA 序列在 NCBI 網(wǎng)站用 BLAST進行序列比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 拮抗菌防治效果測定 取一定量的番茄種子，播種到裝有1 000 g滅菌土的營養(yǎng)缽中。待番茄苗長到5葉期時進行接種實驗，將大小一致、生長狀態(tài)良好的番茄苗分為4個處理組，3個實驗組和1個對照組，每組番茄苗15株，重復(fù)3次。實驗中所用灰葡萄孢菌的孢子懸浮液濃度為1×106個/mL，拮抗菌的發(fā)酵液濃度為1×108個/mL。實驗組1：噴霧接種拮抗菌CM3，24 h后接種病原菌；實驗組2：噴霧接種拮抗菌Y-30，24 h后接種病原菌；實驗組3：噴霧接種拮抗菌Y-48，24 h后接種病原菌；對照組：無菌水噴霧，24 h后接種病原菌。接種后保持溫度（20±1）℃，相對空氣濕度90%以上，10 d后進行病害調(diào)查，隔10 d再調(diào)查1次。此期間對番茄進行正常的栽培管理。

病害分級標準：0級：無??；1級：1/5以下葉片發(fā)?。?級：1/5-2/5葉片發(fā)??；3級：2/5-3/5葉片發(fā)病；4級：3/5-4/5葉片發(fā)病；5級：4/5以上葉片發(fā)病。

病情指數(shù)=［∑（病害的級別×該級別的植株數(shù)）/（病害的最高級別×總株數(shù)）］×100

防治效果（%） =（1-處理病情指數(shù)/對照病情指數(shù)）×100%

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離、純化和鑒定

2.1.1 病原菌的菌落特征 從感染灰霉病的番茄果實表面，分離純化出1株病原菌，命名為BC2016-2。此菌株在PDA培養(yǎng)基上可以正常生長，生長溫度為22℃。菌絲生長初期為灰白色，貼著培養(yǎng)基生長，生長速度較快，4 d左右可長滿培養(yǎng)皿，菌絲顏色慢慢加深，變成灰褐色，氣生菌絲很茂盛、質(zhì)地較為疏松，但長度較短。菌絲產(chǎn)生孢子后菌落表面成粉狀，可以觀察到氣生菌絲頂端有灰褐色的孢子產(chǎn)生，在產(chǎn)孢后期會在培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色不規(guī)則狀的菌核，大小不一，在（2-4）mm×（1-3）mm之間。菌落不產(chǎn)生色素，菌落背面不變色，但會產(chǎn)生發(fā)霉的氣味。

顯微鏡下觀察，病原菌分生孢子梗為灰褐色，有隔膜，頂端膨大，其上著生大量分生孢子，形似葡萄穗狀，分生孢子為單孢，近圓形或橢圓形，無色或淡色（圖1）。

2.1.2 病原菌的分子鑒定 病原菌BC2016-2的ITS序列在NCBI上進行比對分析，與基因庫中已知的灰葡萄孢菌ITS序列高度同源，相似性為99%（圖2）。

2.2 病原菌的拮抗菌篩選和鑒定

從實驗室保存的109株芽孢桿菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，挑選出了3株拮抗菌，編號為CM3、Y-30和Y-48（圖3）。其中CM3是一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien），已經(jīng)報道過其對草莓灰霉病有較強的抑制作用，其發(fā)酵上清液性質(zhì)穩(wěn)定，適合開發(fā)成微生物制劑［3］；Y-30和Y-48是新篩選到的兩株抑制灰霉病菌效果明顯的菌株。表1顯示的是3種菌株在平板對峙實驗中的結(jié)果，可以看到菌株Y-48的抑菌率最高，達到75.41%。

圖1 灰葡萄孢菌的菌落形態(tài)以及孢子顯微鏡圖片

圖2 根據(jù)病原菌BC2016-2的ITS序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 菌株CM3、Y-30和Y-48對灰葡萄孢菌BC2016-2的抑制率

圖3 拮抗菌對灰葡萄孢菌的抑制結(jié)果

2.2.1 菌株Y-30的鑒定 通過形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)菌株Y-30 在PDA培養(yǎng)基上乳白色不透明菌落，菌落表面粗糙，邊緣呈鋸齒狀。由生理生化實驗結(jié)果（表2）可知，菌株Y-30與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的生理生化特征基本相同，初步鑒定為巨大芽孢桿菌。

表2 巨大芽孢桿菌Y-30的生理生化鑒定結(jié)果

菌株Y-30的 16S rDNA 片段測序結(jié)果表明，該片段全長為1 345 bp。將測定的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比較，通過比對發(fā)現(xiàn)菌株Y-30與Bacillus megaterium 的同源性為99%，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征指標，確定菌株Y-30為巨大芽孢桿菌。

2.2.2 菌株Y-48的鑒定 形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)菌株Y-48在PDA培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，菌落表面會形成褶皺突起，菌落邊緣較規(guī)則。生理生化實驗（表3）可知，Y-48與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］描述的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）的生理生化特征基本相同，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 根據(jù)拮抗菌Y-30的16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 解淀粉芽孢桿菌Y-48的生理生化鑒定結(jié)果

菌株Y-48的 16S rDNA 片段測序結(jié)果表明，該片段全長為1 364 bp。將測定的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比較，比對結(jié)果顯示菌株Y-48與Bacillus amyloliquefacien的同源性均為99%，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征指標，確定菌株Y-48為解淀粉芽孢桿菌。

圖5 根據(jù)拮抗菌Y-48的16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗菌預(yù)防灰霉病的效果實驗

盆栽實驗結(jié)果顯示（表4），分離到的灰葡萄孢菌BC2016-2能夠引起番茄植株的灰霉病，病情指數(shù)比較嚴重，達到81.33。篩選到的3株拮抗菌都能夠抑制灰霉病的發(fā)生，其中解淀粉芽孢桿菌Y-48（處理組3）的預(yù)防效果最好，達到72.13%；CM3（處理組1）的預(yù)防效果次之，為65.58%，巨大芽孢桿菌Y-30（處理組2）的預(yù)防效果較低，為54.1%。

表4 拮抗菌的防治效果

3 討論

分離鑒定病原菌是植物病害研究的基礎(chǔ)性工作，使用分子技術(shù)對病原菌進行鑒定已經(jīng)成為一種常用、快速、靈敏且準確可靠的手段。本研究根據(jù)ITS序列分析的結(jié)果，再結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，將分離到的菌株BC2016-2確定為灰葡萄孢菌，結(jié)果更加真實可靠。王瑞虎等［14］結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法，鑒定從番茄果實上分離的菌株t08016b為灰葡萄孢菌，同時發(fā)現(xiàn)燕麥培養(yǎng)基上灰葡萄孢菌的產(chǎn)孢量較高，所以判斷燕麥中可能存在促進灰葡萄孢產(chǎn)生孢子的因子。李誠等［15］通過病原菌形態(tài)特征、致病性測定及rDNA-ITS的同源性分析，確定江西奉新獼猴桃灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌。

本研究中以菌株BC2016-2為指示菌，篩選到了3株抑制作用明顯的菌株，分別為CM3、Y-30和Y-48。其中，菌株CM3是本實驗室在草莓根際分離出的一株對草莓灰霉病菌有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌［3］，菌株CM3發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌成分有穩(wěn)定的性能及較強的環(huán)境適應(yīng)性，未來可以開發(fā)成微生物制劑，用來進行草莓灰霉病的生物防治。菌株Y-30和Y-48都是實驗室保藏的菌株，通過生理生化實驗和16S rDNA 序列檢測，將菌株Y-30確定為巨大芽孢桿菌，菌株Y-48確定為解淀粉芽孢桿菌。盆栽實驗表明：3株拮抗菌對分離到的灰葡萄孢菌均有良好的防治效果，菌株Y-48的效果最好，菌株CM3和Y-30的效果次之。

在目前的生物防治研究中，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌已經(jīng)是較為常用的生防菌，而巨大芽孢桿菌的研究則相對較少。時?。?6］在番茄根際土壤中篩選到了168株具有拮抗作用的拮抗菌，其中芽胞桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，共有126株。王曉輝等［17］從大黑山林間土壤中篩選出了一株生防菌K1，通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列鑒定為解淀粉芽孢桿菌，菌株K1可以抑制灰葡萄孢菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)等代謝過程。向亞萍等［18］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B1619菌株分泌的脂肽類抗生素對番茄枯萎病菌生長有強烈的抑制作用。徐大勇等［19］從番茄植株內(nèi)部分離篩選到菌株XF136，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其對灰葡萄孢菌有較強拮抗作用，濃度為 20%的發(fā)酵濾液對番茄灰霉病的防治效果高于 50%多菌靈 600倍液。秦?。?0］發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌B196可以對水稻稻瘟病菌等7種植物病原菌有較強的抑菌活性。

實驗室分離出的生防菌株往往在生產(chǎn)實踐中得不到預(yù)期的效果，這主要是因為實驗室環(huán)境和外界土壤環(huán)境存在相當大的差異，外界環(huán)境的不確定性導(dǎo)致單一的微生物防治方法難以進行大規(guī)模推廣［21-22］。因此，我們需要改良傳統(tǒng)防治方法，將微生物防治方法與其他的防治方法進行有機結(jié)合［23］，形成新穎的綜合防治方法。例如，牛芳勝［24］發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌與啶酰菌胺聯(lián)合使用后，對番茄灰霉病的抑制率為61.17%，而二者單獨使用的抑制率分別為 48.19%和0.97%。毛雪琴等［25］的田間小區(qū)試驗結(jié)果表明菌株MT-06和2 mg/mL甲霜錳鋅混配后，對小麥赤霉病的防治效果超過了5 mg/mL甲霜錳鋅單獨施用的效果。因此，將微生物菌劑和化學(xué)藥劑或者植物精油［26］配合使用可以獲得更強的抑菌結(jié)果，得到1+1＞2的防治效果，這會是未來防治植物病害的研究以及發(fā)展方向。

4 結(jié)論

本研究從番茄病果上分離到了1株病原菌，命名為BC2016-2，根據(jù)ITS序列分析的結(jié)果和菌株形態(tài)特征，將菌株BC2016-2鑒定為灰葡萄孢菌。以菌株BC2016-2為指示菌，篩選到了3株抑制作用明顯的菌株，分別為CM3、Y-30和Y-48，其中菌株CM3和Y-48為解淀粉芽孢桿菌，菌株Y-30確定為巨大芽孢桿菌。盆栽實驗結(jié)果顯示，3株菌對灰葡萄孢菌BC2016-2引起的番茄灰霉病有良好的生物防治效果，防治效果分別為65.58%、54.1%和72.13%。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Isolation and Identification of Pathogenic Fungus of Botrytis cinerea and Screening of Antagonistic Bacteria Against Tomato Gray Mold

CHEN Zhe HUANG Jing ZHAO Jia LIANG Hong
（Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agriculture Science，Taiyuan 030031）

It is well known that Botrytis cinerea is one of the most geographically widespread plant pathogen on tomato. A fungus BC2016-2 was successfully isolated from the tomato surface and identified as B. cinerea，a pathogen of tomato gray mold. Then，three strains with obvious inhibitory effects were screened using B. cinerea BC2016-2 as indicator fungus，and they were Bacillus amyloliquefacien CM3，Bacillus megaterium Y-30 and Bacillus amyloliquefaciens Y-48. The greenhouse pot experiment showed that the control effects of CM3，Y-30 and Y-48 on the tomato gray mold caused by B. cinerea BC2016-2 were 65.58%，54.1% and 72.13%，respectively.

Botrytis cinerea；Bacillus amyloliquefaciens；Bacillus megaterium；biological control

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0217

2017-03-21

山西省科技自主創(chuàng)新能力提升項目（2015zzcx-22），山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（201601D202062）

陳哲，女，碩士研究生，研究方向：拮抗微生物以及抑菌物質(zhì)開發(fā)；E-mail：yankunchen2015@163.com

梁宏，男，本科，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：lh1964@126.com