胡佳瑤, 張梅妍, 王振靈, 魏 娜, 高炳淼

海南醫(yī)學(xué)院, 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口 571199

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海馬總蛋白提取及其酶解條件優(yōu)化

胡佳瑤, 張梅妍, 王振靈, 魏 娜, 高炳淼*

海南醫(yī)學(xué)院, 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?571199

為了提取海馬總蛋白并確定最佳的酶解條件，將海馬粉碎后采用水提法提取海馬總蛋白。分別選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在不同酶解pH、時(shí)間、溫度和E/S條件下進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)海馬總蛋白的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和BCA法來分別檢測(cè)不同條件下的酶解情況及其蛋白含量，根據(jù)蛋白水解度來確定其最佳的酶解條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從10 g干海馬中提取總蛋白為1.056 g，蛋白濃度為0.106 g/mL。海馬總蛋白的最佳水解酶為堿性蛋白酶，其最佳酶解條件為：pH 9,E/S為5%,溫度為50℃,時(shí)間為3 h，獲得海馬總蛋白的最大水解度為96.9%。研究獲得了海馬總蛋白及其最佳酶解條件，并為海馬多肽生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

海馬；蛋白；酶解條件；優(yōu)化

海馬(Hippocampus)隸屬于魚綱海龍目海龍科，是一種海洋硬骨魚類動(dòng)物，作為一種藥食同源的珍貴物種，素有“南方人參”的美譽(yù)[1,2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，海馬具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、抗血栓、鎮(zhèn)痛和激素樣作用[3,4]。海馬所含化學(xué)成分主要有甾體類合成物、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等[5～7]。近年來科研工作者主要專注于研究海馬的化學(xué)成分，而忽略了對(duì)其水溶性組分中蛋白質(zhì)、多糖、多肽和核酸的研究[8]。其中生物活性多肽具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗疲勞、降血壓和降血脂等功能，且可作為藥物或藥物的前體，使用安全，人體吸收速率比氨基酸高，所以日益受到人們的重視[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用水提法提取海馬中的總蛋白，研究不同蛋白酶、pH、酶與底物質(zhì)量比(E/S)、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)海馬蛋白酶解的影響。采用水解度為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件，以期為海馬多肽的生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

干海馬購買于海口市養(yǎng)年堂大藥房，經(jīng)鑒定為小海馬；中性蛋白酶(上海一研生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶(上海廣銳生物科技有限公司)；胰蛋白酶(湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司)；堿性蛋白酶(太原發(fā)凱化工有限公司)；蛋白Marker(上海偉進(jìn)生物科技有限公司)；BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?？粕齼x器有限公司)；高速粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)字型pH計(jì)(杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司)；恒溫水浴鍋(上海啟前電子科技有限公司)。

1.3 海馬總蛋白的提取

稱取干燥海馬10 g剪碎，用高速粉碎機(jī)粉碎，用去離子水100 mL提取，在4℃下浸泡24 h，將浸泡好的小海馬進(jìn)行離心，4 000 r/min離心5 min，將離心好的上清液保存下來，得到粗品，將粗品保存至-80℃冰箱，進(jìn)行真空冷凍干燥，凍成干粉，保存至-20℃冰箱凍干備用。

1.4 總蛋白和多肽的測(cè)定

總蛋白和水解后多肽均采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒法來測(cè)定，具體實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行操作。

1.5 海馬總蛋白及其多肽的SDS-PAGE分析

按配方配制膠，取出10 μL凍干水提液與10 μL 2×Loading Buffer緩沖液混勻，取Marker 10 μL，置水浴鍋中95℃煮沸5 min，1 000 r/min離心2 min后取上清上樣，電泳90 min后，經(jīng)染色液在搖床上染色6 h，進(jìn)行脫色觀察，用凝膠成像系統(tǒng)掃描照相記錄電泳結(jié)果。

1.6 酶解條件優(yōu)化

稱取海馬總蛋白若干份，選取不同的蛋白酶、pH、溫度、時(shí)間、E/S(酶用量)對(duì)其進(jìn)行酶解處理。然后對(duì)其抽提、濃縮、稱重，以水解度為參考指標(biāo)，以確定pH、溫度以及酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響。酶解產(chǎn)物經(jīng)30 kDa超濾管離心，收集濾液(小于30 kDa酶解多肽)，經(jīng)BCA法測(cè)定多肽含量。水解度(%)=(多肽含量/總蛋白量)×100%。通過單因素和正交試驗(yàn)分析，以確定最佳的酶解條件。

1.6.1 酶的種類對(duì)海馬蛋白水解度的影響 選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶在各自理論最適條件下酶解海馬總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分別分析以上4種酶對(duì)海馬蛋白水解度的影響；并以表1中具體酶解條件為標(biāo)準(zhǔn)，用BCA法測(cè)定各個(gè)酶解產(chǎn)物的水解度從而選出酶解總蛋白的最佳蛋白酶。

表1 4種蛋白酶活性的最適條件

1.6.2 酶解pH對(duì)海馬蛋白水解度的影響 取200 μL海馬蛋白濃縮液，分別在 pH 7、8、9、10、11條件下，55℃酶解3 h；以pH為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)作圖。

1.6.3 酶解溫度對(duì)海馬蛋白水解度的影響 取200 μL海馬蛋白濃縮液，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下，pH為9時(shí)酶解3 h；以酶解溫度為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)作圖。

1.6.4 酶解時(shí)間對(duì)海馬蛋白水解度的影響 取200 μL海馬蛋白濃縮液，在 pH為9，55℃條件下分別酶解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h；以酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)作圖。

1.6.5 酶解E/S對(duì)海馬蛋白水解度的影響 取200 μL海馬蛋白濃縮液，分別控制酶解pH為9，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55℃，分別控制E/S 為 1%、2%、3%、4%、5%；以E/S為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)作圖。

1.6.6 正交試驗(yàn) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素，使用正交實(shí)驗(yàn)用于研究海馬總蛋白與堿性蛋白酶的最佳水解條件。pH、溫度、時(shí)間、E/S被選為獨(dú)立變量，采用4因素3水平L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表2)，水解度是因變量。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 海馬總蛋白提取及含量測(cè)定

通過水提法獲得的海馬總蛋白如圖1所示，經(jīng)BCA蛋白定量法測(cè)定結(jié)果表明，從10 g干海馬中提取到的總蛋白為1.056 g，蛋白濃度為0.106 g/mL。從圖1可以看出，10 μL樣品溶液通過SDS-PAGE電泳顯示較明顯，海馬總蛋白的分子量主要分布在約97.4 kDa，部分位于31 kDa左右，14.4 kDa以下部分蛋白較少。

圖1 海馬總蛋白的電泳分析Fig.1 Electrophoretic analysis of total protein of Hippocampus.M：低分子量蛋白Marker；1、2：10 μL海馬蛋白樣品；3：5 μL海馬蛋白樣品

2.2 蛋白酶種類對(duì)海馬總蛋白酶解的影響

不同種類的蛋白酶對(duì)海馬總蛋白的水解度數(shù)據(jù)如表3，水解度從高到低依次為堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶，選擇水解度最大的一種酶作為最佳蛋白酶。海馬總蛋白水解后的電泳結(jié)果見圖2，其中泳道4為堿性蛋白，水解效果最好。因此，結(jié)合水解度和電泳結(jié)果可以得出對(duì)海馬總蛋白酶解效果最佳的是堿性蛋白酶，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表3 4種不同蛋白酶對(duì)小海馬總蛋白的水解效果

圖2 不同種蛋白酶酶解海馬總蛋白電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of total protein from Hippocampus hydrolyzed by different proteases.M：極低分子量蛋白Marker；1：未酶解海馬蛋白樣品；2：木瓜蛋白酶酶解樣品；3：中性蛋白酶酶解樣品；4：堿性蛋白酶酶解樣品；5：胰蛋白酶酶解樣品

2.3 pH對(duì)海馬蛋白水解度的影響

由圖3可以看出在55 ℃，酶解3 h條件下，當(dāng) pH為7～9時(shí)海馬蛋白的水解度隨pH升高而不斷升高，而當(dāng)pH大于9時(shí)由于酶的活性受到影響，水解度也隨之明顯下降。 因此，pH為9時(shí)堿性蛋白酶對(duì)海馬總蛋白水解效果最好，因此，選取8～10為正交試驗(yàn)pH范圍。

2.4 酶解溫度對(duì)海馬蛋白水解度的影響

由圖4可以看出在pH為9，酶解3 h的條件下，當(dāng)溫度為55℃時(shí)海馬蛋白的水解度最大。因此，55℃為堿性蛋白酶的最適溫度，正交試驗(yàn)選取50℃、55℃、60℃為正交試驗(yàn)溫度范圍。

圖3 pH對(duì)海馬蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of pH on proteolysis of Hippocampus protein.

圖4 酶解溫度對(duì)海馬蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on proteolysis of Hippocampus protein.

2.5 酶解時(shí)間對(duì)海馬蛋白水解度的影響

由圖5可以看出在55℃，pH 為9的條件下，當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí)海馬蛋白的水解度最大。因此，確定3 h為堿性蛋白酶的最適時(shí)間，為正交試驗(yàn)提供了酶解時(shí)間范圍為1 h、3 h和5 h。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)海馬蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on proteolysis of Hippocampus protein.

2.6 酶解E/S對(duì)海馬蛋白水解度的影響

由圖6可以看出在55℃，pH為9的條件下，當(dāng)酶解E/S為4%時(shí)海馬蛋白的水解度最大。E/S為4%為堿性蛋白酶的最適濃度比，為正交試驗(yàn)提供了酶與底物比例范圍為3%、4%和5%。

圖6 E/S對(duì)海馬蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of E/S on proteolysis of Hippocampus protein.

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)正交表的極差分析表明，對(duì)酶解海馬蛋白水解度影響最大的是時(shí)間，其次是pH、溫度和E/S(表4)，最佳水平組合為：A2B3C1D2。因此，堿性蛋白酶的最佳酶解條件為：pH為9、E/S為5%、溫度為50℃、時(shí)間為3 h。在最佳酶解條件下，驗(yàn)證海馬蛋白的水解度得出：海馬蛋白的水解度達(dá)到了96.9%。

表4 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

3 討論

中藥海馬資源珍貴，活性成分豐富，尤其是含有豐富的蛋白質(zhì)成分，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)海馬藥物資源的高值化利用，對(duì)其蛋白質(zhì)及其酶解后的多肽生物活性研究顯得尤為重要[10]。因此，本研究采用水提法提取了海馬總蛋白，并采用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化蛋白酶及其酶解條件。盛琳等[11]采用4種不用溶劑提取海馬有效成分，得出用水和醇兩種溶劑可保證海馬有效成分的得率。本研究主要是采用水提法來提取海馬總蛋白，水提法提取的總蛋白較多，實(shí)驗(yàn)步驟簡單、快速且不影響后續(xù)蛋白酶的活性。

本研究以水解度作為酶解指標(biāo)，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)法相結(jié)合來優(yōu)化酶解影響因素。目前關(guān)于海馬蛋白酶解研究的報(bào)道不斷增多，袁學(xué)會(huì)等[12]通過采用單酶對(duì)海馬進(jìn)行酶解工藝與清除DPPH工藝進(jìn)行研究。陳成波等[13]研究了三斑海馬液化蛋白的酶解提取工藝和酶解液的抗氧化活性。劉琪等[14]對(duì)海馬的粉末經(jīng)過中性蛋白酶酶解后發(fā)現(xiàn)其含有豐富的多肽和氨基酸，這些多肽和氨基酸具有抗氧化活性。姜展志[15]采用單酶和復(fù)合酶對(duì)海馬蛋白進(jìn)行了酶解條件優(yōu)化，需先進(jìn)行胰蛋白酶酶解再進(jìn)行堿性蛋白酶酶解才能獲得好的酶解效果，得出堿性蛋白酶最佳條件為酶解溫度54.70℃、酶解時(shí)間6 h、酶解pH 8.99。本研究采用單因素對(duì)不同種蛋白酶進(jìn)行優(yōu)化，獲得堿性蛋白酶為酶解海馬蛋白的最佳酶，再經(jīng)正交試驗(yàn)獲得最佳酶解條件為：pH為9、E/S為5%、溫度為50℃、時(shí)間為3 h。本文優(yōu)化獲得酶的種類、酶解pH和溫度與姜展志[15]的報(bào)道相似，但時(shí)間縮短了50%，提高了酶解效率，且在最佳條件下僅采用堿性蛋白酶即可完全水解海馬總蛋白，水解度達(dá)到96.9%，無需復(fù)雜的復(fù)合酶進(jìn)行水解過程。

因此，本研究獲得酶解海馬總蛋白的最佳條件，可為海馬資源的深入開發(fā)利用和海馬多肽的生物學(xué)功能研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] 張改霞, 劉金欣, 賈 靜, 等. 基于COI條形碼的海馬藥材及其混偽品分子鑒定[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2015, 50(17):1469-1473.

[2] Lin Q, Luo W, Wan S M. De novo transcriptome analysis of two seahorse species (HippocampuserectusandH.mohnikei) and the development of molecular markers for population genetics[J]. PLoS ONE, 2016，11(4):e0154096.

[3] 許東暉, 許實(shí)波. 三斑海馬提取物抗血栓藥理研究[J].中藥材, 1995, 18(11):573-574.

[4] 馮 星, 巫志峰, 楊 柳, 等. 中藥海馬提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷的藥理作用[J]. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 2(1):1-4.

[5] Su Y T, Xu Y J. Study on the extraction and purification of glycoprotein from the yellow seahorse,HippocampusKuda Bleeker[J]. Food Sci. Nutr., 2015, 3(4):301-302.

[6] 朱 苗, 謝 勇, 盧忠英, 等. 海馬活性成分提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣州化工, 2015, 41(10):19-32.

[7] 許益民, 陳建偉, 郭 戌. 海馬和海龍中磷脂成分與脂肪酸的分析研究[J].中國海洋藥物, 1994, 49(1):14-18.

[8] 徐汪偉, 魏 晴, 高炳淼, 等. 苯酚-硫酸法測(cè)定中藥海馬總多糖的含量的研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 36(3):391-392.

[9] 林端權(quán), 郭澤鑌, 張 怡, 等. 海洋生物活性肽的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 18:367-372.

[10] 姜素芬, 吉愛國, 梁 浩, 等．我國海馬的研究進(jìn)展[J].中藥材, 2007, 30(7): 884-887.

[11] 盛 琳, 羅海燕, 張俊清, 等. 海馬制劑處理方法的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2011, 25(2):55-57.

[12] 袁學(xué)會(huì), 陳成波, 陳 政, 等. 三斑海馬酶解工藝的優(yōu)化及其液化蛋白對(duì)DPPH的清除作用[J]. 食品工業(yè)科技, 2011 (9): 291-293.

[13] 陳成波, 袁學(xué)會(huì), 陳 政. 三斑海馬液化蛋白的提取及抗氧化研究[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2011(3):329-331.

[14] 劉 琪, 董美玲, 張 紅, 等. 海洋藥物—海馬酶解液活性的研究[J]. 河北漁業(yè), 2015(9):10-29.

[15] 姜展志. 海馬骨粉多肽制備及其抗氧化活性研究[D]. 浙江寧波:寧波大學(xué), 碩士學(xué)位論文，2014.

Extraction and Optimization of Hydrolysis Conditions of Total Protein fromHippocampus

HU Jiayao, ZHANG Meiyan, WANG Zhenling, WEI Na, GAO Bingmiao*

HainanProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofTropicalMedicinalPlants,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China

In order to extract total protein ofHippocampusand optimize conditions for enzymatic hydrolysis, we extracted the total protein ofHippocampusby the method of water extraction of driedHippocampus. Papain, alkaline protease, neutral protease and trypsin were used respectively under the different pH, time, temperature and E/S conditions to conduct single factor test, and finally the enzymatic hydrolysis conditions were optimized by orthogonal test. The enzymatic hydrolysis condition and protein content under different conditions were determined by SDS-PAGE and BCA, respectively. The optimal enzymolysis conditions were determined according to the degree of proteolysis shown in the charts. The results showed that 1.056 g total protein was extracted from 10 g driedHippocampus, and its protein concentration was 0.106 g/mL. The best enzyme was alkaline protease. The best enzymatic conditions were pH 9, E/S 5%, hydrolysis temperature 50℃and hydrolysis time 3 h, and the degree of hydrolysis of theHippocampusprotein was 96.9%. The optimal enzymatic hydrolysis conditions have been determined, and the study laid a certain foundation for the study of biological activity of hippocampal polypeptide.

Hippocampus; protein; hydrolysis conditions; optimization

2017-02-21; 接受日期：2017-03-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560611)；海南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20150084)；海南醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(hycx2014060)資助。

胡佳瑤，本科生，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬?。E-mail: 61587122@qq.com。*通信作者：高炳淼，副教授，研究方向?yàn)槟纤幣c海洋藥物資源開發(fā)。E-mail: gaobingmiao@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0011