楊婧，賈彥＊＊，王蔚，戚基萍，劉宏，代巧妹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病理教研室哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院哈爾濱150001）

膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織硫氧還蛋白系統(tǒng)的影響＊

楊婧1，賈彥1＊＊，王蔚1，戚基萍2，劉宏1，代巧妹1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病理教研室哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院哈爾濱150001）

目的：驗證“膈下逐瘀湯抑制大鼠纖維化肝臟組織氧化應激的作用是通過增強硫氧還蛋白系統(tǒng)而實現(xiàn)”這一假說。方法：SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組，正常大鼠+膈下逐瘀湯組、模型大鼠+膈下逐瘀湯組。大鼠免疫性肝纖維化模型通過每周2次每只大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL的方法制備。同時按含生藥每天7.37 g·kg-1的劑量給予膈下逐瘀湯灌胃給藥干預。采用分光光度法檢測肝臟組織中脂質過氧化物（Lipid Peroxidation，LPO）含量、硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin Reductase，TrxR）活性、PCR檢測編碼核轉錄因子E2相關因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2，Nrf2）基因Nfe2l2的表達，利用Western blot檢測硫氧還蛋白-1（Thioredoxin-1，Trx1）蛋白表達和Akt磷酸化水平。結果：與模型對照組大鼠比較，膈下逐瘀湯組大鼠纖維化肝臟組織LPO含量顯著降低，Trx1蛋白表達和TrxR活性顯著提高，Akt磷酸化水平顯著增加，Nfe2l2 mRNA表達顯著上調（均P<0.05）。結論：膈下逐瘀湯增強機體肝臟硫氧還蛋白系統(tǒng)與其活化Akt-Nrf2信號通路有關，從而預防大鼠纖維化肝臟組織氧化應激狀態(tài)，本實驗結果為支持假說提供了實驗依據。

肝纖維化膈下逐瘀湯氧化應激硫氧還蛋白系統(tǒng)核轉錄因子E2相關因子2

肝纖維化是由病毒性和自身免疫性肝炎、鐵沉積、酒精性肝病和膽汁淤積等病因引起的慢性肝病進展至肝硬化的必經階段[1]。迄今為止，臨床上尚缺乏特異性針對肝纖維化的有效逆轉或阻止其進展的藥物[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，經典方膈下逐瘀湯可以改善實驗性大鼠肝纖維化，抑制肝星狀細胞活化和細胞外基質形成[3-5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激是肝纖維化形成和肝星狀細胞活化的重要機制，抗氧化已成為防治肝纖維化治療的策略之一[6]。為了探究膈下逐瘀湯抗肝纖維化的機制是否與其抗氧化特性有關，本研究提出膈下逐瘀湯保護大鼠纖維化肝臟組織氧化應激損傷的作用是通過增強硫氧還蛋白系統(tǒng)而實現(xiàn)的這一假說。為了驗證這一假說，本研究采用豬血清腹腔注射誘導大鼠免疫性肝纖維化模型，觀察了氧化應激相關指標，為明確膈下逐瘀湯抗肝纖維化的作用機制提供實驗數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，為同一批次7周大小雄性60只大鼠，許可證編號：SCXK京2002-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20℃-23℃；相對濕度45%-55%，按每籠5只飼養(yǎng)，自然光照，正常攝食飲水，環(huán)境安靜，通風良好。飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。

1.1.2 主要儀器與試藥

Smart Chemi?圖像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；JY-ZY5和JY-SCZ2電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀（Agilent公司）；S1000?Thermal Cycler（美國BIORAD公司生產）；ELX800全自動酶標儀（美國BioTek公司），XPE504分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

SYBRExScriptTMRT-PCR Kit、總RNA提取試劑RNAiso Reagent（大連寶生物工程有限公司，Cat號分別是：DRR031A、B13031）。Nfe2l2（NM_031789）和GAPDH（NM_017008）基因序列通過美國國立生物技術中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）庫獲得，用Primer Primier 5.0引物設計軟件設計Nfe2l2和GAPDH引物。Nfe2l2上游引物5′-CCC AGC ACA TCC AGA CAG AC-3′，下游引物5′-TAT CCA GGG CAA GCG ACT C-3′，擴增產物大小為195 bp；GAPDH上游引物5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′，下游引物5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′，擴增產物大小為143 bp。引物均由生物工程（上海）股份有限公司合成。脂質過氧化物檢測試劑盒（Cayman公司，Cat：705002）。硫氧還蛋白還原酶活性分光光度分析試劑盒（BioVision公司，Cat：K763-100）。p-Akt抗體（Santa Cruz公司，Cat：sc-16646-R）；GAPDH抗體、Akt抗體、Trx1抗體（Cell Signaling公司，Cat號分別是：#2118、#4685、#2429）。細胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，Cat：P0028）；Super Signal?West Pico Chemiluminescent Substrate（美國Thermo公司，Cat：PH203837）。

豬血清（上海緯群生物技術有限公司，批號：20081214）；膈下逐瘀湯由五靈脂∶當歸∶丹皮∶桃仁∶川芎∶烏藥∶赤芍∶玄胡索∶甘草∶香附∶紅花∶枳殼比例為4∶6∶4∶6∶4∶4∶4∶2∶6∶3∶6∶3組成。各味中藥從齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院購買，經齊齊哈爾醫(yī)學院牛英才研究員鑒定均為正品。按中醫(yī)傳統(tǒng)方法煎煮2次，水煎液濃縮成含生藥1.5 g·mL-1，分裝置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥

60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，即正常對照組、模型組、正常大鼠+膈下逐瘀湯組、模型大鼠+膈下逐瘀湯組。以每周2次，每次每只大鼠腹腔注射0.5 mL的NaCl注射液或豬血清，正常對照組、正常大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠腹腔注射NaCl注射液，模型組和模型大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠腹腔注射豬血清。膈下逐瘀湯按體重給藥，給藥劑量根據人臨床使用劑量通過每公斤體重占有體表面積相對比值計算所得。在造模的同時，正常對照組和模型組大鼠每天連續(xù)灌胃給予生理鹽水，而正常大鼠+膈下逐瘀湯組和模型大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠每天連續(xù)灌胃給予膈下逐瘀湯（每天劑量為生藥7.37 g·kg-1），共12周。

1.2.2 分光光度法檢測LPO含量

肝臟組織勻漿取上清，按照Cayman公司LPO檢測試劑盒說明書檢測。

1.2.3 分光光度法檢測TrxR活性

肝臟組織勻漿取上清，按照硫氧還蛋白還原酶活性分光光度分析試劑盒說明書檢測。

1.2.4 Real-time PCR檢測大鼠Nfe2l2 mRNA表達

采用RNAiso Reagent試劑盒提取肝臟組織總RNA，cDNA合成采用PrimeScript?RT Reagent kit。采用SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒檢測Ct值，Nfe2l2 mRNA表達的相對定量采用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.2.5 Western blot法檢測大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達和Akt磷酸化

蛋白提取試劑盒抽提肝臟組織蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肝臟組織蛋白，電泳結束后再將蛋白質轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉/ TBST室溫封閉120 min后，加入一抗4℃孵育過夜，加入相應二抗，室溫孵育2 h后，進行化學發(fā)光反應、顯影、定影和印跡條帶的積分光密度分析。

1.2.6 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 膈下逐瘀湯預防了豬血清誘導的氧化應激（圖1）

與空白對照組比較，豬血清組大鼠肝臟組織中LPO含量顯著增加（P<0.05）。與豬血清組比較，豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織LPO含量顯著降低（P<0.05）。

2.2 膈下逐瘀湯增強了肝臟組織硫氧還蛋白系統(tǒng)（圖2）

與空白對照組比較，正常大鼠+膈下逐瘀湯組和豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達和TrxR活性顯著增加（均P<0.05）。豬血清組與空白對照組大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達和TrxR活性無顯著性差異。

2.3 膈下逐瘀湯活化了肝臟組織Akt-核轉錄因子E2相關因子2信號通路（圖3）

與空白對照組比較，正常大鼠+膈下逐瘀湯組和豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織Akt磷酸化水平和Nfe2l2 mRNA表達顯著增加（均P<0.05）。豬血清組與空白對照組大鼠肝臟組織中Akt磷酸化和Nfe2l2 mRNA表達無顯著性差異。

3 討論

膈下逐瘀湯是王清任在《醫(yī)林改錯》中獨創(chuàng)的經典方劑，具有活血行氣、祛瘀止痛的功效。由桃仁、丹皮、當歸、川芎、紅花、赤芍、烏藥、延胡索、五靈脂、枳殼、香附和甘草等12味藥物組成。中醫(yī)理論認為，肝纖維化具有瘀血的特征[7]，歸屬于脅痛和癥瘕等病的范疇。越來越多的證臨床研究表明，氣滯血瘀是肝纖維化最主要的證型，貫穿肝纖維化發(fā)病的過程，是肝纖維化最重要的病因之一[8]，血瘀是乙型肝炎病毒等濕熱邪毒引起的重要病理產物[9]。本研究結果支持了我們的假說，顯示膈下逐瘀湯預防了豬血清腹腔注射誘導的肝臟組織氧化應激，雖然豬血清對硫氧還蛋白系統(tǒng)和Akt-Nrf2信號通路有輕微的影響，但是這種影響沒有達到統(tǒng)計學意義。膈下逐瘀湯對病理和生理狀態(tài)下的硫氧還蛋白系統(tǒng)和Akt-Nrf2信號通路均具有顯著的增強/活化作用。

圖1 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織LPO含量的影響。

本研究采用的豬血清誘導的免疫性肝纖維化與人類肝纖維化的形成原因有一定相似之處，肝纖維化持久且致纖維化的過程中對肝細胞無損[10]，因此在評價藥物特別是中藥復方療效中較化學中毒性肝纖維化模型有顯著特色和優(yōu)勢[11]。Ge等研究發(fā)現(xiàn)，機體反復接受異體血清引起體內產生大量的免疫復合物，進而導致Kupffer細胞產生大量細胞因子，誘導臟肝纖維化發(fā)生[12]。我們采用腹腔注射豬血清（每只0.5 mL，每周2次）成功的制備大鼠免疫性肝纖維化模型，VG染色[4]、HE染色[5]和Masson染色[3]；其實驗結果顯示，腹腔注射豬血清誘導了大鼠肝臟組織大量的膠原沉積。郝瑞春等[13]研究發(fā)現(xiàn)，免疫性肝纖維化大鼠機體存在氧化應激，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，但是腹腔注射豬血清誘導氧化應激的機制尚不明確，需要將來進一步研究。

圖2 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織中Trx1蛋白表達和TrxR活性的影響。

圖3 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織中Akt磷酸化和Nfe2l2 mRNA表達的影響。

肝細胞比其他細胞具有更強的抗氧化功能[14]。Mohammadalipour等[15]研究發(fā)現(xiàn)，多數致肝損傷的因素可引起活性氧的過量產生和抗氧化能力的減弱，導致氧化應激狀態(tài)。氧化應激參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，肝臟纖維化與氧化應激之間的因果關系受到廣泛的關注。肝炎病毒能夠誘導活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產生，ROS能夠活化肝星狀細胞和導致肝纖維化形成[16]。由于氧化應激是肝纖維化發(fā)病的主要機制之一，減輕氧化應激以及增強機體抗氧化防御能力的抗氧化治療策略，可能逆轉或阻止肝纖維化的發(fā)展。目前在臨床上一些常用保護肝細胞的藥物（如水飛薊賓）已經在體外發(fā)現(xiàn)有較強的抗氧化活性，具有抗纖維化的潛質[17,18]。由于膈下逐瘀湯和肝纖維化方證對應，在臨床上治療肝纖維化療效確切[19]。前期研究也發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯具有抗實驗性肝纖維化作用[3]，本研究進一步發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯的抗氧化活性可能使其預防肝纖維化的重要機制。

在研究抗氧化酶的過程中，非酶系統(tǒng)在抗氧化反應中的重要作用已逐漸被許多學者認識[20]。硫氧還蛋白是抗氧化非酶系統(tǒng)的重要成員之一，具有強大的抗氧化作用，發(fā)揮著維持細胞內的氧化還原穩(wěn)態(tài)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著提高了大鼠纖維化肝臟組織Trx1蛋白表達和TrxR活性。有趣的是，膈下逐瘀湯同時也增加了基礎水平的硫氧還蛋白系統(tǒng)，表明膈下逐瘀湯的抗氧化特性與豬血清誘導無顯著相關。

Nrf2是一種含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構轉錄因子，氧化應激等外界因素刺激或抗氧化劑等誘導可增加Nrf2轉錄和核轉位，然后與抗氧化反應元件結合[22，23]，誘導TrxR表達增高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著上調Nfe2l2 mRNA表達，從而提高了纖維化肝臟組織中硫氧還蛋白系統(tǒng)。

絲-蘇氨酸激酶Akt通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等調節(jié)細胞的功能[25]。多項研究證實Nrf2是Akt的靶蛋白之一，Akt抑制劑可抑制Nrf2活性[26]。激活的Akt通過調節(jié)HSC活化、增加Ⅰ型膠原的表達促進肝纖維化的形成[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著顯著的提高了Akt磷酸化水平。本研究雖然發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯通過活化Akt-Nrf2信號通路增強機體抗氧化能力，但膈下逐瘀湯調控Akt-Nrf2信號通路的專屬性需要將來采用基因敲除動物模型進一步明確，這是本研究的不足之處。

綜上所述，膈下逐瘀湯可能活化Akt-Nrf2信號通路增加硫氧還蛋白系統(tǒng)，抑制纖維化肝臟組織氧化應激。

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Effects of Ge-Xia Zhu-Yu Decoction on Hepatic Thioredoxin System in Rats with Hepatic Fibrosis

Yang Jing1,Jia Yan1,Wang Wei1,Qi Jiping2,Liu Hong1,Dai Qiaomei1
(1.Department of Pathology,College of Basic Medicine,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040, China;2.The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

This study was aimed to verify the hypothesis that Ge-Xia Zhu-Yu(GXZY)decoction protects liver from porcine serum-induced oxidative stress through the thioredoxin system.SD rats were randomly divided into the blank control group,model group,normal rat+GXZY decoction group,model rat+GXZY group.The rat autoimmune hepatic fibrosis model was induced with porcine serum by intraperitoneal injection(0.5 mL/each rat)twice a week.And GXZY decoction(7.37 g raw material/kg·d)was simultaneously administered daily by gavage.Lipid peroxidation(LPO)levels and thioredoxin reductase(TrxR)activity in liver tissues were determined by the colorimetric method.Polymerase chain reaction(PCR)was used to analyze the transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nfe2l2,previously known as Nrf2)mRNA expression.And the western blot was used to analyze the thioredoxin-1(Trx1)protein expression and Akt phosphorylation in the liver.The results showed that compared to the model control group,the GXZY decoction group attenuated porcine serum-induced oxidative stress,as indicated by the LPO level,in liver tissues.Furthermore, GXZY decoction significantly enhanced TrxR activity,Trx1 protein expression,Nfe2l2 mRNA expression,and Akt phosphorylation(all P<0.05).It was concluded that the strong antioxidant properties of GXZY decoction in the porcine serum rat model was due to the enhancement of the hepatic thioredoxin system via activating Akt-Nrf2 signaling pathway.The study results provided experimental evidences for the supporting of this hypothesis.

Hepatic fibrosis,Ge-Xia Zhu-Yu decoction,oxidative stress,thioredoxin ssystem,transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2

10.11842/wst.2017.04.025

R285

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-04-06

修回日期：2017-04-20

＊國家自然科學基金委青年科學基金項目（81603418）：膈下逐瘀湯干預循環(huán)miRNA治療非酒精性脂肪性肝纖維化的機制研究，負責人：楊婧。

＊＊通訊作者：賈彥，教授，主要研究方向：中醫(yī)藥防治肝纖維化的基礎研究。