劉旭朝，劉金欣，孫偉，宋經(jīng)元，石林春，孫稚穎

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院濟(jì)南250355；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室北京100193；3.承德醫(yī)學(xué)院/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室承德067000；4.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點實驗室北京100700）

動物藥材DNA提取方法優(yōu)化和市售藥材DNA條形碼鑒定研究＊

劉旭朝1，2，劉金欣2,3，孫偉4，宋經(jīng)元2，石林春2，孫稚穎1＊＊

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院濟(jì)南250355；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室北京100193；3.承德醫(yī)學(xué)院/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室承德067000；4.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性檢測評估北京市重點實驗室北京100700）

目的：對動物藥材DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，利用優(yōu)化方法提取市售動物藥材DNA并進(jìn)行DNA條形碼鑒定。方法：基于SDS法DNA提取原理，比較裂解液中不同EDTA濃度（0.025、0.25、0.5 mol·L-1）、是否含NaCl和Triton X-100等因素對不同用藥部位動物藥材DNA提取質(zhì)量的影響，篩選得到最佳裂解液配方；使用優(yōu)化的裂解液配方提取121份市售動物藥材DNA并進(jìn)行基原物種鑒定。結(jié)果：裂解液配方為1%SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl對不同用藥部位動物藥材DNA提取效果最佳，并可實現(xiàn)對蟬蛻等提取困難樣本DNA的提??；利用優(yōu)化裂解液提取的121份市售動物藥材DNA滿足中藥材分子鑒定后續(xù)實驗要求，所有市售動物藥材均可準(zhǔn)確鑒定到基原物種。結(jié)論：本研究優(yōu)化的裂解液配方可用于除殼類、分泌物類、加工品外不同用藥部位動物藥材的DNA提取，為動物藥材分子鑒定提供了技術(shù)支持。

動物藥材DNA條形碼DNA提取裂解液EDTA

根據(jù)第三次全國中藥資源普查結(jié)果，中國藥用動物有1 581種，目前，77種藥用動物、50種動物藥材被收入2015版《中國藥典》（一部）[1]。動物藥材多數(shù)來源復(fù)雜，多取自動物體某一部分，常存在較多破碎的器官、組織，給傳統(tǒng)鑒別帶來挑戰(zhàn)[2]。近年來藥用野生動物資源日益減少，藥材商品供應(yīng)量不足[3]，部分動物藥材、飲片價格昂貴，藥材市場中摻偽、造假現(xiàn)象時有發(fā)生，如用赤鏈蛇幼蛇冒充金錢白花蛇、用青蛙的輸卵管冒充哈蟆油[4]。賈靜等[5]對市售鹿茸粉的基原物種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)71份待檢品中不符合《中國藥典》規(guī)定的樣品占62%。這些問題都已嚴(yán)重影響了動物藥材的用藥安全，動物藥材鑒定需要更多的技術(shù)手段，以保證臨床用藥安全?，F(xiàn)代DNA分子鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速鑒定物種的特點[6]，已廣泛應(yīng)用于中藥材及中藥制劑原料藥的鑒定研究[7]，為保障中藥安全用藥提供了有效工具[8]。

獲取高質(zhì)量DNA是DNA分子鑒定的基礎(chǔ)。目前，動物藥材DNA常使用試劑盒提取，需根據(jù)用藥部位的不同選用不同的試劑盒：蛇類、蛤蚧、地龍等藥材肌肉組織豐富，使用通用的動物組織DNA提取試劑盒可獲得較高質(zhì)量DNA[9-11]；角類、骨甲類等藥材因DNA含量較低，需使用專用的DNA out試劑盒提取DNA[12，13]；但是，使用試劑盒提取復(fù)雜動物藥材DNA常受到限制，如蟬蛻等動物藥材無適用商品試劑盒提取DNA。本研究以SDS法DNA提取原理為基礎(chǔ)[14]，通過改良其裂解液配方，以不同用藥部位的動物藥材（全體類、角類、骨甲類、組織類、其他類）為研究對象，與常規(guī)SDS方法和常規(guī)商品試劑盒進(jìn)行比較，嘗試建立一種適用范圍廣的動物藥材DNA提取方法，并利用該方法對市售動物藥材進(jìn)行DNA分子鑒定，以期為《中國藥典》動物藥材DNA分子鑒定研究提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器和試劑

PL203型號電子天平（上海梅特勒-特利多儀器有限公司）；MM400混合型研磨儀（德國Retsch公司）；移液槍（德國Eppendrof公司）；75002445型離心機(jī)（美國Thermo公司）；Nano Drop 2000（美國Thermo公司）；型號？電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYY-8C）；76S/ 06945型凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）。

通用試劑盒選用進(jìn)口、國產(chǎn)2類，進(jìn)口試劑盒以DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN公司，批號：56304）為代表，國產(chǎn)試劑盒以血液/細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：DP304-02）為代表，角甲類動物藥材選用柱式骨骼DNAout試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司，批號：91102-50），3種試劑盒分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ符號代替。

十二烷基磺酸鈉（SDS，北京索來寶科技有限公司，批號：S8010）、1.0 mol·L-1Tris-HCl（pH=8.0，北京索來寶科技有限公司，批號：T8230）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA disodiumsalt，AMRESCO公司，批號：E0105-500G）、Proteinase K（Merck Millipore公司，批號：539480-10GM），酚：氯仿：異戊醇（25：24：1，北京博奧拓公司，批號：20160721），氯仿（北京化工廠，批號：20161008）、異戊醇（北京化工廠，批號：160131）、異丙醇（北京化工廠，批號：20140417）、無水乙醇（北京化工廠，批號：20160218）、氫氧化鈉（北京化工廠，批號：20090326）、氯化鈉（北京化工廠，批號：20141204）等為分析純。

1.2 實驗材料

除殼類（如牡蠣等）、分泌物類（如麝香等）、加工品（如鹿角膠等）等動物藥材較難用于DNA分子鑒定技術(shù)外，本研究收集全體類、角類、骨甲類、組織類、其他類（卵鞘等）等不同用藥部位的市售動物藥材26種，共121份樣品，購自北京同仁堂藥店、安徽亳州藥市、河北安國藥市、四川荷花池藥市、廣西玉林藥市、中國藥材集團(tuán)，樣品保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所（表1）。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

取藥材樣品，使用75%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）擦拭樣品表面，置于經(jīng)紫外線消毒的通風(fēng)櫥內(nèi)30 min以揮干乙醇。稱取全體類、組織類、其他類藥材各20-30 mg（哈蟆油稱取5 mg）；稱取角類、骨甲類藥材各40-50 mg。全體類、組織類藥材用剪刀（已滅菌）剪碎，用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min（30次/秒）；角類、骨甲類藥材用液氮研磨儀充分研磨至細(xì)粉；哈蟆油使用研磨杵研碎。

2.2 DNA提取裂解液配方優(yōu)化

選取烏梢蛇、九香蟲、鱉甲、水牛角、蟬蛻、哈蟆油等樣品作為全體類、角類、骨甲類、組織類、其他類動物藥材的代表，進(jìn)行預(yù)實驗，基于SDS法DNA提取原理，優(yōu)化裂解液配方，具體試驗步驟：①EDTA濃度優(yōu)化：分別配制含0.025、0.25、0.5 mol·L-1EDTA（pH=8）的裂解液PE，提取6種動物藥材DNA，考察EDTA濃度對動物藥材DNA提取的影響，優(yōu)選出EDTA最佳濃度；②配方組成優(yōu)選：在裂解液中分別加入或去除0.2 mol·L-1NaCl和1%Triton X-100考察是否可影響DNA得率。

2.3 方法學(xué)比較

分別使用本方法與Ⅰ號、Ⅱ號試劑盒提取6種動物藥材DNA，Ⅲ號試劑盒提取鱉甲、水牛角DNA，試劑盒操作流程按照說明進(jìn)行。采用微量分光光度計（美國NanoDrop 2000）測定DNA濃度及ODA260/A280，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；比較本方法與3種試劑盒提取的DNA濃度、純度及PCR擴(kuò)增成功率。

2.4 市售動物藥材DNA分子鑒定

采用優(yōu)化的DNA提取方法提取121份市售動物藥材DNA，進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增及雙向測序，獲得樣品COI序列，基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)[15]進(jìn)行物種鑒定。序列擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)處理依照中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則進(jìn)行[16]。

3 結(jié)果

3.1 裂解液配方優(yōu)化

為獲得適用于不同用藥部位動物藥材DNA提取的裂解液PE配方，本研究基于SDS法對裂解液中EDTA濃度、配方組成進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，以0.25 mol·L-1EDTA配制的裂解液，適用于不同用藥部位的動物藥材DNA提取；在裂解液中加入0.2 mol·L-1NaCl可提高DNA得率，1%Triton X-100的添加對DNA得率無顯著影響。確定裂解液PE4為最佳配方：1% SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl（表2）。采用本方法對6種動物藥材DNA提取，結(jié)果顯示，烏梢蛇、九香蟲藥材DNA濃度均大于200 ng·μL-1，ODA260/A280處于1.8~2.0之間；水牛角、鱉甲藥材DNA濃度均大于50 ng·μL-1，ODA260/A280分別為1.76和1.77；蟬蛻藥材DNA濃度為55.0 g·μL-1，ODA260/A280為1.76；哈蟆油藥材DNA濃度為77 g·μL-1，ODA260/A280為1.90（表3）。

表1 不同用藥部位動物藥材樣品采集信息

3.2 方法學(xué)比較分析

采用裂解液配方PE4提取動物藥材DNA，與3種試劑盒提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量比較。結(jié)果顯示，裂解液配方PE4對不同用藥部位的動物藥材DNA提取均有較高的適用性，提取的6種動物藥材DNA濃度、純度較高；Ⅰ號、Ⅱ號通用動物組織DNA提取試劑盒對全體類動物藥材DNA提取有較高的適用性，對骨甲類、組織類藥材DNA提取適用性較低；Ⅲ號骨骼DNA out試劑盒提取的骨甲類藥材DNA濃度較高，但DNA純度較低（表4）。

表2 裂解液PE配方優(yōu)化

表3 不同配方裂解液PE提取結(jié)果

PCR擴(kuò)增對DNA模板的質(zhì)量要求較高，因此PCR擴(kuò)增成功率成為評判DNA質(zhì)量的重要依據(jù)[17]。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，本方法提取的DNA模板PCR擴(kuò)增成功率最高，6種藥材DNA樣品PCR產(chǎn)物均有明亮清晰的條帶；Ⅰ號、Ⅱ號試劑盒僅烏梢蛇、九香蟲DNA擴(kuò)增成功，Ⅲ號試劑盒提取的鱉甲、水牛角DNA可擴(kuò)增成功（圖1）。

3.3 市售動物藥材DNA條形碼分子鑒定結(jié)果

登錄中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，選擇中藥材DNA條形碼動物藥材數(shù)據(jù)庫，對所采購的市售動物藥材基原物種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，121份市售動物藥材均符合2015版《中國藥典》的基原物種（表5）。

4 討論

4.1 EDTA濃度是動物藥材DNA提取的關(guān)鍵

EDTA是一種離子螯合劑，能與二價金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。角類、骨甲類等動物藥材多由高度鈣化的角質(zhì)細(xì)胞或骨細(xì)胞組成，成分復(fù)雜，質(zhì)地堅硬，一定濃度的EDTA可使骨細(xì)胞等脫去礦物質(zhì)，并通過螯合Mg2+、Ca2+等二價陽離子使DNA酶失活[18]。常規(guī)SDS法裂解液配方中EDTA濃度常為0.005-0.025 mol·L-1，但是實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解液中EDTA濃度為0.025 mol·L-1時，DNA提取效果并不理想。本研究對裂解液中EDTA濃度進(jìn)行了10倍、20倍梯度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)EDTA濃度為0.25 mol·L-1時，裂解液對不同用藥部位的動物藥材裂解效果較好，DNA提取效果最佳，所有動物藥材樣品DNA濃度均大于40 ng·μL-1，ODA260/A280在1.60-2.02之間；但是EDTA濃度過高，會影響提取效率，當(dāng)EDTA濃度為0.5 mol·L-1時，DNA得率降低；實驗發(fā)現(xiàn)，在裂解液中加入0.2 mol·L-1NaCl可提高DNA得率，而添加1%Triton X-100對提高DNA得率無顯著影響。

表4 裂解液PE4與3種試劑盒提取的DNA質(zhì)量比較（DNA濃度ng/μL/ODA260/A280）

圖1 不同DNA提取方法進(jìn)行COI序列擴(kuò)增的電泳結(jié)果

4.2 優(yōu)化的裂解液配方為市售動物藥材DNA提取提供了技術(shù)手段

DNA提取是中藥材DNA分子鑒定的關(guān)鍵[19]，與新鮮組織不同，動物藥材多為動物的整體或某一部分、生理或病理產(chǎn)物[20]，DNA提取方法差異較大，常需根據(jù)用藥部位的不同，選用不同的試劑盒[16]，如九香蟲、烏梢蛇等含肌肉組織豐富的動物藥材選用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒可獲得較高質(zhì)量DNA；鱉甲、水牛角等角甲類需使用骨骼專用DNA提取試劑盒。常規(guī)SDS法對不同用藥部位的動物藥材，處理方式也有所不同，如提取骨甲類等藥材DNA時常需要脫鈣等方法的處理[21]；而蟬蛻等DNA較難提取的品種，目前尚未有其藥材DNA分子鑒定研究的報道；這些問題都制約了動物藥材DNA分子鑒定技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。使用本研究優(yōu)化的裂解液配方對2015版《中國藥典》收載不同用藥部位的26種121份市售動物藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定，結(jié)果表明，所有市售動物藥材與《中國藥典》規(guī)定的基原物種一致。優(yōu)化的裂解液配方與試劑盒提取和傳統(tǒng)提取方法相比，重復(fù)性強(qiáng)，通用性好，為市售動物藥材DNA提取提供了新方法。

4.3 優(yōu)化的裂解液配方為中成藥DNA提取及DNA自動化提取提供了潛在的技術(shù)支持

隨著現(xiàn)代DNA分子鑒定研究的不斷深入，DNA分子鑒定技術(shù)已逐步應(yīng)用于中成藥等復(fù)方制劑中原料藥的鑒定。Coghla等[22]采用高通量測序技術(shù)對15種不同劑型的中成藥中原料藥進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明DNA分子鑒定技術(shù)與高通量測序技術(shù)結(jié)合可檢測中成藥中原料藥成分，有助于監(jiān)測中藥產(chǎn)品的合法性和安全性；Newmaster等[23]采用DNA分子鑒定技術(shù)對北美44種草藥產(chǎn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)59%的樣品中含有未在標(biāo)簽上列出的物種，此技術(shù)為監(jiān)測草藥產(chǎn)品原料提供了最有效方法；Lo等[24]利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對單方和復(fù)方人參湯劑中人參進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明DNA分子標(biāo)記技術(shù)可用于鑒定人參湯劑中人參、西洋參成分。中成藥等復(fù)方制劑常由多種藥材混合加工而成，DNA提取相對復(fù)雜，以含動物藥材成分的中成藥為例，臨床用于治療虛勞久咳，年老哮喘的蛤蚧定喘丸中含有蛤蚧、鱉甲動物藥材成分，傳統(tǒng)手工DNA提取方法需選用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取蛤蚧DNA，骨骼DNA out試劑盒提取鱉甲DNA，操作繁瑣，困難較大。此外，手工DNA提取方法成本高，效率低，易受到實驗環(huán)境和人為因素的影響。目前，DNA自動化提取已成功應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域[25,26]，實現(xiàn)DNA提取統(tǒng)一化、自動化是中藥材DNA分子鑒定的必然趨勢。本研究建立的方法可用于不同用藥部位的動物藥材DNA提取，為中成藥DNA提取及DNA自動化提取提供了潛在的技術(shù)支持，在后續(xù)的研究中我們將完善此裂解配方在該領(lǐng)域的應(yīng)用，為實現(xiàn)DNA提取統(tǒng)一化、自動化奠定基礎(chǔ)。

表5 市售動物藥材材鑒定結(jié)果列表

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DNAExtraction Method Optimization forAnimal Medicines and Identification of CommercialAnimal Medicines Using DNABarcoding

Liu Xuzhao1,2,Liu Jinxin2,3,Sun Wei4,Song Jingyuan2,Shi Linchun2,Sun Zhiying1
(1.School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.Institute of Medicinal Plant Development/Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193, China;3.Chengde Medical University/Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine,Chengde 067000,China;4.Institute of Chinese Materia Medica/Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

The DNA extraction method of animal medicine material is difficult and un-unified,which limits the application of molecular identification to identify animal medicines.In this study,based on the DNA extraction theory of SDS,we assessed the effects of three elements including different EDTA concentrations(0.025 mol·L-1,0.25 mol·L-1, and 0.5 mol·L-1)and whether containing NaCl and Triton X-100 in the lysis buffer on the quality of DNA extracted fromdifferent kinds of animal medicine.The optimized lysis buffer was used to extract DNA from 121 commercial animal medicines for original and species identification.The results showed that the lysis buffer of 1%SDS,0.03 mol·L-1Tris-HCl,0.25 mol·L-1EDTA and 0.2 mol·L-1NaCl had the optimum effect on DNA extraction.This lysis buffer can obtain DNA from animal medicine which is difficult to extract,such as Cicadae periostracum.The DNA extractions of 121 commercial animal medicines by optimized lysis buffer can satisfy the experimental requirements for molecular identification.All samples of commercial animal medicines can be accurately identified to the level of species.It was concluded that optimized lysis buffer can be used in the DNA extraction of different kinds of animal medicines except shells,secretions and processed products.This method provides technique support for the molecular identification of animal medicines.

Animal medicines,DNA barcoding,DNA extraction,lysis buffer,EDTA

10.11842/wst.2017.04.010

R931.2

A

（責(zé)任編輯：張彩峰，責(zé)任譯審：王晶）

2017-03-28

修回日期：2017-04-20

＊國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目分任務(wù)（201507002-4-1-2）：海龍等4種名貴珍稀動物藥及混偽品鑒定技術(shù)及應(yīng)用規(guī)范，負(fù)責(zé)人：張輝；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程本草基因組協(xié)同創(chuàng)新團(tuán)隊（2016-I 2M-3-016）：負(fù)責(zé)人：宋經(jīng)元。

＊＊通訊作者：孫稚穎，副教授，主要研究方向：藥用植物資源與分類鑒定研究。