李慧玉，王玉剛，袁梽漪，雷帆，王欣佩，盧希，邢東明，李俊，杜力軍＊＊

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物藥理實(shí)驗(yàn)室北京100084；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶400016；3.清華大學(xué)藥學(xué)院北京100084；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌330006）

小檗堿對(duì)大腸桿菌基因轉(zhuǎn)錄抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究＊

李慧玉1，王玉剛1，袁梽漪2，雷帆3，王欣佩1，盧希1，邢東明1，李俊4，杜力軍1＊＊

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物藥理實(shí)驗(yàn)室北京100084；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶400016；3.清華大學(xué)藥學(xué)院北京100084；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌330006）

目的：對(duì)小劈堿（BBR）對(duì)大腸桿菌的抑制作用的分子靶點(diǎn)進(jìn)行探討。方法：鑒于BBR對(duì)DNA結(jié)合的偏好性，本文從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平對(duì)BBR的大腸桿菌生長(zhǎng)抑制作用靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果：BBR對(duì)于大腸桿菌基因上游調(diào)控元件UP element具有較強(qiáng)的親和力，而在此元件地轉(zhuǎn)錄起始區(qū)含有TATA堿基序列。進(jìn)一步對(duì)啟動(dòng)子上游含有UP element調(diào)控元件的基因sulA、recA、16S和啟動(dòng)子上游不含UP element調(diào)控元件的基因lpxC、secG、mutT的mRNA表達(dá)比較表明，BBR抑制sulA、recA、16S的表達(dá)，對(duì)lpxC、secG、mutT無明顯作用，提示TATA序列是BBR的作用靶點(diǎn)。結(jié)論：本結(jié)果對(duì)從基因轉(zhuǎn)錄水平探討B(tài)BR抑菌作用提供了新思路。

小檗堿大腸桿菌基因轉(zhuǎn)錄TATA box

小檗堿（Bererine，BBR）具有廣譜抑制病原微生物作用，臨床上常用于治療細(xì)菌性腹瀉。許多研究對(duì)其抑菌作用的靶點(diǎn)主要集中在蛋白質(zhì)或代謝水平上，例如：BBR抑制細(xì)胞分裂蛋白FtsZ的組裝而阻礙細(xì)胞分裂[1，2]；或是抑制細(xì)菌體內(nèi)糖代謝過程中的丙酮酸氧化，使細(xì)菌對(duì)維生素B6和煙酰胺等的利用受到限制而產(chǎn)生抑菌作用[3]。由于BBR是一種DNA配體，在體外可與單鏈/雙鏈的DNA結(jié)合[4-7]，可以通過與細(xì)菌體內(nèi)DNA結(jié)合從而影響其復(fù)制而發(fā)揮抑菌作用。BBR能夠利用其平面空間結(jié)構(gòu)特征，“TA”堿基偏好性地插入到DNA雙螺旋的小溝中[8]，利用X衍射技術(shù)證實(shí)了BBR能與DNA結(jié)合[9]。因此，推測(cè)BBR的抑菌活性可能是由于它與富含A/T堿基的雙螺旋DNA小溝的特異性結(jié)合所致[10]。實(shí)驗(yàn)室早期的研究證實(shí)BBR可以進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，并同TATA box結(jié)合蛋白TBP競(jìng)爭(zhēng)，與mRNA啟動(dòng)子上游調(diào)控元件TATA box結(jié)合，干擾基因轉(zhuǎn)錄起始，從而抑制TATA box依賴的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。綜上提示，在抑菌作用中BBR的這種與DNA結(jié)合的特性可能是其發(fā)揮抑菌作用的內(nèi)在分子機(jī)制。為證實(shí)這一假設(shè)，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

細(xì)菌培養(yǎng)搖床（太倉(cāng)科技器材廠華利達(dá)試驗(yàn)設(shè)備公司）；GeneQuant 100紫外分光光度計(jì)（美國(guó)GeneralElectric公司）；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；MDF-382E低溫冰箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺(tái)（北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司）。Tprofessional Gradient PCR儀（德國(guó)Biometra公司）；5417R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；FR-200A型全自動(dòng)紫外與可見分析裝置（上海復(fù)日科技有限公司）；垂直電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）。680型酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD公司）；Light Cycle П Real-Time PCR儀（瑞士Roche公司）。

鹽酸小檗堿（純度99%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氨芐青霉素（Ampicillin，上海生工生物工程股份有限公司），配制為0.1 g·mL-1的母液保存；瓊脂培養(yǎng)板：用營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）配制成濃度為2%的溶液，高壓滅菌后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中制成培養(yǎng)板備用；肉湯培養(yǎng)基（上海生工生物工程股份有限公司）：LB液體培養(yǎng)基，高壓滅菌備用。

大腸桿菌K-12野生菌菌株（由本研究室保存）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA連接酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker I、DNA Marker IV、DNA Marker D2000（北京天根生物技術(shù)公司，批號(hào)分別是：CB101、RT406、DP302、KT109、DP209、MD101、MD104、MD114）；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物公司，批號(hào)：CD601）；pUCm-T線性載體（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：B522211）；凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)DNA探針序列由上海生工合成；原核表達(dá)載體pET-21b（美國(guó)Novagen公司，批號(hào)：70763）；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindШ、BamHⅠ（立陶宛Fermentas公司，批號(hào)分別是：ER0581、SM0192、ER0051）；小鼠抗His標(biāo)簽單抗、羊抗小鼠IgG/HRP標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)研究所有限公司，批號(hào)分別是：TA-02、ZDR-5307）；預(yù)染蛋白彩色Marker（7-175KD）（美國(guó)BioLabs公司，批號(hào)：P7702V）；Biotin 3’End Labeling Kit（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：89818）；Light Shift Chemilu?minescent EMSA Kit（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：20148）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 BBR抑菌濃度

BBR對(duì)大腸桿菌的最小抑制濃度（Minimum In?hibition Concentration，MIC）的確定采用試管二倍稀釋法[12]。實(shí)驗(yàn)用BBR以滅菌的LB液體培養(yǎng)基溶解配制成1 mg·mL-1的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，再以LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行二倍稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1共5個(gè)藥物濃度梯度。將已培養(yǎng)過夜（約16-18 h）的大腸桿菌菌液，轉(zhuǎn)接100 μL于新鮮LB液體培養(yǎng)基中同條件繼續(xù)培養(yǎng)2 h，菌生長(zhǎng)同步且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600為0.1-0.2（約1×1011CFU·L-1）；然后將菌液用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍（約1×109CFU·L-1）作為接種濃度,每試管加入0.1 mL菌液。

實(shí)驗(yàn)選用5個(gè)藥物濃度梯度，每濃度培養(yǎng)液的體積為3 mL，設(shè)3個(gè)平行組，設(shè)立不加實(shí)驗(yàn)菌的本底對(duì)照；此外，還設(shè)立一組含有0.1 mg·mL-1氨芐青霉素的陽性對(duì)照組和未加入藥物的陰性對(duì)照組。加入藥物及大腸桿菌的試管于37℃，160 rpm搖床培養(yǎng)22 h后進(jìn)行判定：輕搖試管見絮狀渾濁者為抑菌陰性，澄清者為陽性，陰性的最大藥物濃度和陽性的最小藥物濃度作為其抑菌范圍。同時(shí)，測(cè)定每管OD600nm，與未加藥物的試管進(jìn)行比較，以觀察不同濃度的藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的程度。

1.3 大腸桿菌基因組DNA的提取

將已培養(yǎng)過夜（約18 h）的大腸桿菌菌液,轉(zhuǎn)接100 μL于新鮮LB液體培養(yǎng)基中同條件繼續(xù)培養(yǎng)2 h，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600為0.6-0.8時(shí)），按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)菌全基因組DNA。

1.4 大腸桿菌RNA聚合酶α亞基(RNAP-α)高表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以上面提取的基因組DNA為模板，參照NCBI genebank上給出的大腸桿菌K-12 RNA聚合酶α亞基的編碼序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物，按照如下方法獲得目的DNA片段。RNA聚合酶α亞基RNAP-α引物序列：正向：5′-TATGCAGGGTTCT?GTG ACGAG-3′，反向：5′-GTACTCGTCAGCGAT?GCTTG-3′。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并采用天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分離純化目的DNA片段，將獲得的目的DNA片段用T4 DNA連接酶與pUCm-T線性載體連接。將所得到的連接產(chǎn)物取10 μL按照操作手冊(cè)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用Gene?Quant 100紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提質(zhì)粒DNA的OD260nm和OD280nm，進(jìn)行濃度標(biāo)定和純度檢測(cè)，-20℃凍存?zhèn)溆谩⒂蒙鲜龇椒ㄌ崛〉馁|(zhì)粒DNA采用雙酶切鑒定正反向插入子。挑選正向連接的陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并用20%的甘油于-80℃保存菌種。取1 mL菌液進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)DNA序列在DNAman軟件中進(jìn)行生物信息學(xué)序列比對(duì)。將測(cè)序正確的克隆命名為pUCmT-α。將上述測(cè)序正確的pUCmT-α菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，并用SDS堿裂解法提取大量pUCmT-α質(zhì)粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ雙酶切,電泳純化回收RNAP-αDNA片段，與原核表達(dá)載體pET-21b相同的雙酶切純化回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物按上面所述方法轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)平板，挑取單克隆并采用雙酶切鑒定正確連接的質(zhì)粒。將正確連接的克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用20%的甘油于-80℃保存菌種，獲得的重組質(zhì)粒命名為pET-21b-α。

1.5 RNA聚合酶α亞基（RNAP-α）的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將測(cè)序正確含有RNA聚合酶α亞基高表達(dá)質(zhì)粒（pET-21b-α）的單克隆搖菌，次日按1∶100轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600nm=0.6-0.8，取出1mL菌液（誘導(dǎo)前），剩余菌液加入終濃度為0.25mM的IPTG誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)4-5 h。同樣取誘導(dǎo)后的菌液1 mL，將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后的菌液分別12 000 rpm，1 min離心收集菌體，棄上清后加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min使菌體裂解，用12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)RNAP-α蛋白是否高表達(dá)。同時(shí)為了確證高表達(dá)的蛋白確實(shí)是我們所構(gòu)建的RNA聚合酶α亞基，采用了Western blot技術(shù)對(duì)菌體誘導(dǎo)表達(dá)的上清液進(jìn)行鑒定。

1.6 凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BBR對(duì)RNAP-α與UP element結(jié)合的影響

參照文獻(xiàn)[13,14]，根據(jù)所研究的目的蛋白及其所結(jié)合的保守DNA序列設(shè)計(jì)并合成DNA探針序列。用Bio?tin 3′End Labeling Kit參照說明書分別將UP element-1，UP element-2、-10 element-1、-10 element-2四條單鏈DNA的3′OH末端標(biāo)記生物素。凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)DNA探針序列:UP element-1:5′-TCAGAAAAT?TATTTTAAATTTCCTCTTGTCAGGC-3′；UP element-2：5′-GCCTGACAAGAGGAAATTTAAAAT-AATTTTCTGA-3′；-10 element-1：5′-CAG GCTTTACACTTTATGCTTCC?GGCTCGTATAATGTGTGGA-3′；-10 element-2：5′-TCCACAC ATTATACGAGCCGGA-AGCATAAA GTG?TAAAGCCTG-3′。UP element DNA探針與RNA聚合酶α亞基的結(jié)合實(shí)驗(yàn)參照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit說明書進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)過程中，預(yù)先將UP ele? ment DNA探針與不同濃度的BBR（0.1、1、10、100 μg· mL-1）孵育后，進(jìn)行蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合反應(yīng)。通過凝膠電泳可將與RNA聚合酶α亞基結(jié)合的探針與游離的探針分離開，最后用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 凝膠電泳遷移（EMSA）實(shí)驗(yàn)考察BBR與核心轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合的偏好性

本實(shí)驗(yàn)室之前通過等溫滴定（ITC）實(shí)驗(yàn)觀察到：BBR與模式探針的結(jié)合系數(shù)隨著探針?biāo)琓A堿基數(shù)量的增加而增加[15]?？紤]到細(xì)菌啟動(dòng)子元件-10 ele?ment也是富含A/T堿基，但其長(zhǎng)度比UP element短很多。為了考察BBR在結(jié)合力上對(duì)TA堿基的偏好性是否是其干擾RNAP-α與UP element結(jié)合的原因，我們利用EMSA體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BBR對(duì)RNAP-б與-10 el?ement結(jié)合的影響。EMSA具體參照試劑盒操作程序進(jìn)行。

1.8 Trizol法提取大腸桿菌總RNA

將大腸桿菌K-12野生菌搖菌活化，次日按1∶100轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至早期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600nm=0.4-0.6，然后將菌液分配成對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組（每組采集4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：0.5 h、1 h、2 h、4 h），向?qū)嶒?yàn)組中加入BBR溶液，使其終濃度為300 μg·mL-1，接近該藥物對(duì)大腸桿菌的半數(shù)抑制濃度IC50，繼續(xù)同條件培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，分別離心收集菌體，Trizol法提取RNA[16]。

1.9 Real-time PCR檢測(cè)特定的基因轉(zhuǎn)錄

分別以對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的總RNA為模板，用EasyScript Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品中的所有RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA[17]。以目的檢測(cè)基因的DNA序列作為模板，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成用來特異性檢測(cè)目的基因表達(dá)的引物。Sul A(151bp)：正向：5′-CTTCGTCGTTCTCAT CCG-3′，反向：5′-TGCTGACCGAGTTGCTGT-3′；Rec A(138bp)：正向：5′-TGGCGGG TAACCTGAAGCA-3′，反向：5′-CGAGA CGAACAGAG GCGTAGAAT-3′；16S(129 bp)：正向：5′-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3′，反向：5′-A TCTACGATTACTAGCGATTCCA-3′；Lpx C (102 bp)：正向：5′-CGATGAACTTCTCCGCT GATG-3′,反向：5′-G GCCAAACCACGGGACTG-3′；Sec G (147 bp)：正向：5′-CGCTTCCGC TACGCTGTT-3′，反向：5′-TTTTCCCATTCGCTACCTCTATT-3′；Mut T (100 bp)：正向：5′-TT CAGGAAGAGGTCGGGATTAC-3′，反向：5′-ACCAGCCAGAACCACAGAGTTAT-3′。Rpo A(192):正向：5′-GGAAACCAACGGCACAAT-3′，反向：5′-CAGTTA GCA GAGCGGACA-3′。以RNA聚合酶α亞基編碼基因Rpo A作為內(nèi)參基因[18]。Realtime PCR檢測(cè)按照RealMasterMix（SYBP Green）試劑盒進(jìn)行[19]。

圖1 BBR體外對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用（n=3）

圖2 大腸桿菌RNA聚合酶α亞基編碼序列的特異擴(kuò)增（A）和pUCm-T-α正向連接重組質(zhì)粒酶切鑒定（B）

1.10 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)大腸桿菌的抑制濃度

結(jié)果顯示BBR濃度低于1 mg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組，試管中均有不同程度的渾濁現(xiàn)象，而1 mg·mL-1實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液仍為澄清；取該實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液100 μL涂布無抗性的LB瓊脂平板，37℃、16 h培養(yǎng)后沒有明顯的菌落出現(xiàn)。綜合上述實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明BBR對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的MIC=1 mg·mL-1。同時(shí)測(cè)定BBR不同濃度條件下每管菌液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值OD600nm，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理結(jié)果如圖1。根據(jù)圖1A中各藥物濃度條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)率求得相應(yīng)的抑制率，代入計(jì)算公式求得BBR對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50=324.19 μg·mL-1。

2.2 大腸桿菌RNA聚合酶α（RNAP-α）亞基編碼基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組DNA序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約990 bp處出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖2A）。目的基因RNAP-α的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，與pUCm-T線性載體連接，連接的重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm培養(yǎng)過夜，經(jīng)SDS裂解提取質(zhì)粒后采用NdeⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定正向連接的重組質(zhì)粒pUCmT-α，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到與預(yù)期相符的約750 bp的酶切片段條帶（圖2B）。將經(jīng)過雙酶切鑒定并測(cè)序正確的pUCmT-α菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，提取大量pUCmT-α質(zhì)粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ雙酶切，電泳純化回收RNAP-α DNA片段，與原核表達(dá)載體pET-21b相同的雙酶切純化回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)平板，挑取單克隆采用雙酶切鑒定正確連接的質(zhì)粒pET-21bα，將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)，相似度100%且無翻譯移碼。

2.3 RNAP-α亞基的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

pET-21b載體為含有氨芐青霉素抗性基因的原核高效表達(dá)載體，且為融合表達(dá)載體，其本身表達(dá)His-Tag標(biāo)簽蛋白。所表達(dá)的目的蛋白R(shí)NAP-α分子量約為37 KD。在37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，煮沸裂菌后經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果顯示、在37KD左右有一條明顯的高表達(dá)蛋白條帶（如圖3A），與預(yù)期的蛋白分子量大小一致，說明重組表達(dá)菌pET-21b-α在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。為了進(jìn)一步確定該高表達(dá)條帶確實(shí)是我們所構(gòu)建的RNAP-α亞基，通過采用Western blot技術(shù)對(duì)菌體誘導(dǎo)表達(dá)的上清液進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示：利用His-Tag標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡，在分子量大小約37 KD處檢測(cè)到單一的蛋白表達(dá)條帶（如圖3B）。

2.4 BBR對(duì)大腸桿菌RNAP-α亞基與啟動(dòng)子調(diào)控元件結(jié)合的影響

EMSA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們以UP element保守序列作為探針，研究了BBR對(duì)RNAP-α識(shí)別并結(jié)合UP ele?ment的影響。結(jié)果顯示：BBR在終濃度為1 μg·mL-1的劑量下，能在體外有效抑制RNAP-α與UP element的結(jié)合。利用GraphPad 5.0軟件分析計(jì)算可知：BBR在該體外結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中對(duì)RNAP-α結(jié)合UP element抑制作用的半數(shù)抑制濃度IC50為1.311 4 μg·mL-1（圖4A-C）。

圖3 RNA聚合酶α（RNAP-α）亞基的誘導(dǎo)表達(dá)（A）及鑒定（B）

以原核啟動(dòng)子中同樣富含A/T堿基的-10 element保守序列作為探針，對(duì)BBR對(duì)RNAP-б識(shí)別并結(jié)合-10 element的影響進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：BBR雖然也能抑制RNAP-б與-10 element的結(jié)合，但其抑制效率明顯低于其對(duì)RNAP-α與UP element結(jié)合的影響，提示UP element作用的特異性。BBR在該體外結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中對(duì)RNAP-б結(jié)合-10 element抑制作用的半數(shù)抑制濃度IC50為15.465 μg·mL-1（圖4D-F）。

2.5 Trizol法提取大腸桿菌RNA質(zhì)量的評(píng)價(jià)

圖4 體外BBR對(duì)相關(guān)元件結(jié)合的影響（n=3）

圖5 大腸桿菌RNA提取質(zhì)量檢測(cè)及基因組DNA的消化

利用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的RNA的降解情況（圖5A），結(jié)果顯示Trizol法提取的RNA存在基因組DNA污染，且有一定程度的降解，但23S（2.9 kb），16S（1.5 kb）條帶并沒有出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象，可能是非變性電泳時(shí)間過長(zhǎng)、RNA在電泳過程中有所降解所致。為了檢測(cè)DNA酶消化處理后RNA樣品中基因組DNA殘留情況，分別以DNase處理前和處理后的RNA樣品為模板，利用PCR擴(kuò)增特定基因RpoA檢測(cè)PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示（圖5B）與處理前相對(duì)比，用DNase處理后的RNA樣品PCR產(chǎn)物沒有非特異性條帶產(chǎn)生，說明得到了沒有DNA污染的RNA樣品，為后續(xù)的Real-time PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了技術(shù)保證。

2.6 BBR對(duì)啟動(dòng)子上游含有或不含有UP element調(diào)控序列基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

研究表明大腸桿菌中約有26%的基因啟動(dòng)子上游含有此段保守性較差的UP element序列[20,21]。為了探討B(tài)BR是否通過干擾RNAP-α與啟動(dòng)子上游調(diào)控元件UP element的結(jié)合而影響含有此段特征序列的基因的轉(zhuǎn)錄，我們選擇重組蛋白酶A（RecombinaseA，recA），SOS細(xì)胞分裂抑制蛋白（sulA），16S核糖體RNA（rrn?Bp1）這三個(gè)代表基因，采用Real-time PCR的方法檢測(cè)了BBR處理前后其轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。

圖6 BBR對(duì)相關(guān)啟動(dòng)子上游調(diào)控元件基因轉(zhuǎn)錄的影響（n=3）

又文獻(xiàn)報(bào)道此段富含A/T堿基的UP element特征序列作為一個(gè)單獨(dú)的調(diào)控元件，具有明確的激活基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性，在被替換到其他基因的核心啟動(dòng)子上游后仍能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[22]。為了探討B(tài)BR是否會(huì)通過干擾RNAP-α與啟動(dòng)子上游調(diào)控元件UP ele?ment的結(jié)合而影響含有此段特征序列的基因的轉(zhuǎn)錄，我們對(duì)比分析了未加藥組和BBR藥物處理組對(duì)特定基因的轉(zhuǎn)錄水平影響。同時(shí)選擇Lpx C、Sec G、Mut T等3個(gè)基因作為對(duì)比基因，以其啟動(dòng)子上游不含有UP element調(diào)控元件。由圖6A-C可知：與對(duì)照組相比，細(xì)菌SOS反應(yīng)相關(guān)的2個(gè)重要蛋白—recA、sulA，以及16S核糖體RNA（rrnBp1）這三個(gè)啟動(dòng)子上游存在UP element調(diào)控元件的基因轉(zhuǎn)錄水平被顯著下調(diào)。圖6D-F則表明：Lpx C、Sec G、Mut T等三個(gè)啟動(dòng)子上游不存在UP element特征序列的基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比，并沒有明顯變化。以上結(jié)果表明BBR可與啟動(dòng)子上游富含A/T堿基的UP element結(jié)合，從而干擾那些受UP element調(diào)控的基因的轉(zhuǎn)錄起始，影響這些基因的轉(zhuǎn)錄以及后續(xù)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

3 討論

本研究以大腸桿菌為抑制對(duì)象，以TATA為基本觀察靶點(diǎn)，對(duì)BBR的抑菌作用分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。BBR對(duì)大腸桿菌的MIC=1.0 mg·mL-1，BBR其濃度在達(dá)到0.5 mg·mL-1以上時(shí)才出現(xiàn)明顯的抑菌效果也證明了這一點(diǎn)。這很可能與革蘭陰性菌比較特殊的細(xì)胞壁組成有關(guān)，從而導(dǎo)致BBR不易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，此有待于進(jìn)一步研究。為了在體外探究BBR對(duì)RNAP-α與細(xì)菌啟動(dòng)子上游調(diào)控元件UP element結(jié)合的影響，首先，我們需要獲得富含RNAP-α的細(xì)胞提取物，因此我們構(gòu)建了RNAP-α重組表達(dá)菌；同時(shí)，為了盡量使RNAP-α在細(xì)胞提取物的上清液中高表達(dá)，為了進(jìn)一步確定細(xì)胞裂解液中的高表達(dá)蛋白確實(shí)是我們所構(gòu)建的RNA聚合酶α亞基，采用Western blot技術(shù)對(duì)菌體誘導(dǎo)表達(dá)的上清液進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示利用His-Tag標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡，在分子量大小約37 KD處檢測(cè)到單一的蛋白表達(dá)條帶，說明構(gòu)建的RNA聚合酶α亞基融合蛋白已成功表達(dá)，這為我們的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

有研究指出大腸桿菌RNA聚合酶α亞基由2個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，分別是N末端結(jié)構(gòu)域（αNTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（αCTD），二者之間由一個(gè)柔性的linker肽所連接，αCTD的主要功能是負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合UP element調(diào)控序列。在轉(zhuǎn)錄起始過程中，αCTD主要通過與富含A/T堿基的UP element的DNA小溝緊密結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。又，BBR能夠利用其對(duì)“TA”堿基偏好性地插入到DNA雙螺旋的小溝中[8]；BBR可以進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，并同TATA-box結(jié)合蛋白TBP競(jìng)爭(zhēng)，與mRNA啟動(dòng)子上游調(diào)控元件TATA-box結(jié)合，干擾基因的轉(zhuǎn)錄起始，從而抑制TATA-box依賴的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。因此，我們希望知道BBR在進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，是否會(huì)與αCTD競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)合到富含A/T堿基的UP element DNA序列的小溝中，從而干擾RNA聚合酶α亞基與UP element的結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始。首先，通過體外EMSA試驗(yàn)考察了BBR對(duì)RNAP-α與富含A/T堿基的UP element結(jié)合的影響；其次，考慮到細(xì)菌啟動(dòng)子調(diào)控元件-10 element同樣富含AT堿基，但其長(zhǎng)度比UP element短很多，為了探討B(tài)BR在結(jié)合力上對(duì)TA堿基的偏好性是否是其干擾RNAP-α與UP ele?ment結(jié)合的原因，我們考察了BBR對(duì)RNA聚合酶б亞基（RNAP-б）與-10 element結(jié)合的影響。結(jié)果顯示：BBR雖然也能抑制RNAP-б與-10 element的結(jié)合，但其抑制效率明顯低于其對(duì)RNAP-α與UP element結(jié)合的影響，這與我們實(shí)驗(yàn)室之前通過等溫滴定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BBR與模式DNA探針結(jié)合系數(shù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BBR與模式探針的結(jié)合系數(shù)隨著探針?biāo)琓A堿基數(shù)量的增加而增加的特點(diǎn)相一致[11]。

BBR作為一種DNA配體，在體外可與雙鏈DNA結(jié)合，并且這種結(jié)合具有一定的T/A堿基偏好性。BBR的這種對(duì)TA堿基的偏好性導(dǎo)致了其在體外有效地抑制RNAP-α與富含A/T堿基的UP element的結(jié)合；能極大地影響這些基因的轉(zhuǎn)錄效率，因?yàn)榇硕胃缓珹/T堿基的UP element在細(xì)菌體內(nèi)許多含有強(qiáng)啟動(dòng)子的基因上游普遍存在[23]。因此，我們對(duì)BBR的這種在體外可干擾RNAP-α與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件UP element結(jié)合的現(xiàn)象進(jìn)行了細(xì)菌水平的考察。通過采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，我們對(duì)比分析了未加藥組和BBR藥物處理組，各時(shí)間點(diǎn)特定基因在大腸桿菌內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平變化。

結(jié)果表明，BBR能夠下調(diào)上游富含A/T堿基的UP element的recA、sulA、16S等三個(gè)基因的表達(dá)，而對(duì)于Lpx C、Sec G、Mut T等三個(gè)啟動(dòng)子上游不存在UP element特征序列的基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化。RecA，sulA蛋白是細(xì)菌DNA復(fù)制-SOS修復(fù)系統(tǒng)中的重要成員，BBR對(duì)這兩個(gè)蛋白轉(zhuǎn)錄水平的明顯下調(diào)提示：BBR不太可能通過引發(fā)SOS反應(yīng)的方式產(chǎn)生抑菌作用。這與之前有文獻(xiàn)報(bào)道：BBR在SOS反應(yīng)陰性突變株和野生型菌株中均能引起細(xì)胞伸長(zhǎng)，抑制細(xì)胞分裂的結(jié)果相一致[2]；16S rRNA是細(xì)菌核糖體的重要組成成分，BBR對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的明顯下調(diào)，可能意味著蛋白質(zhì)合成裝置—核糖體的組裝將受到影響，細(xì)胞存活所必需的結(jié)構(gòu)蛋白和酶類不能被合成，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

由于細(xì)胞生長(zhǎng)的復(fù)雜性，BBR在調(diào)控這些基因時(shí)具體通過影響到哪一種生理功能而發(fā)揮其抑菌作用，有待進(jìn)一步研究。但是UP element及其所含的TATA作為BBR的分子靶點(diǎn)為我們提供了深入探討B(tài)BR對(duì)微生物調(diào)控的新的視點(diǎn)，有助于探討由于影響腸道菌所影響的機(jī)體多種生理病理功能的紊亂。

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Experimental Study on Inhibition Effect of Berberine in Escherichia coli Gene Transcription

Li Huiyu1,Wang Yugang1,Yuan Zhiyi2,Lei Fan3,Wang Xinpei1,Lu Xi1,Xing Dongming1,Li Jun1,Du Lijun1
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences,School of Life Sciences,Tsinghua University, Beijing 100084,China;2.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;

3.School of Pharmaceutical Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China; 4.State Key Laboratory of Innovative Drugs and Efficient Energy-saving Pharmaceutical Equipment, Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330006,China)

There have been many reports on berberine(BBR)effect of the inhibition on gut bacteria,but more from the protein level.In view of the preference of BBR for DNA binding,we here investigated the expression of BBR from the transcriptional expression level of the gene.The results showed that BBR had a higher affinity for UP element of Escherichia coli(E.coli)gene,and the transcription initiation region of this element contained TATA base sequence.The expression of genes sulA,recA and 16S which contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could be suppressed by BBR,and the expression of lpxC,secG and mutT which did not contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could not be inhibited by BBR.It is shown that the TATA sequence is the target of BBR.This result provides a new perspective for exploring the effect of BBR?s inhibition of microbiota from gene transcription.

Berberine,Escherichia coli,gene transcription,TATA box

10.11842/wst.2017.04.005

R285

A

（責(zé)任編輯：郭嫦娥，責(zé)任譯審：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-04-02

＊國(guó)家自然科學(xué)基金委重大研究計(jì)劃培育項(xiàng)目（90713043）：基于BBR神經(jīng)元保護(hù)作用探討其PI3-K/AKT作用的始動(dòng)位點(diǎn)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)責(zé)人：杜力軍；國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81374006）：基于BBR作為DNA插入子探討其對(duì)正常與缺血再灌神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄作用差異的機(jī)制，負(fù)責(zé)人：邢東明。

＊＊通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：藥理學(xué)。