朱廣雙 胡元亮 曹 侃 王本忠

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，蕪湖241003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095)

硫酸化銀耳多糖和黨參多糖對雞T淋巴細(xì)胞增殖及白細(xì)胞介素-2 mRNA表達(dá)水平的影響

朱廣雙1胡元亮2*曹 侃1王本忠1

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，蕪湖241003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095)

為研究硫酸化銀耳多糖(sTPS70c)和硫酸化黨參多糖(sCPPS50c)增強(qiáng)免疫作用機(jī)理，本試驗(yàn)以未修飾銀耳多糖(TPStp)為對照，采用噻唑藍(lán)(MTT)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定了sTPS70c和sCPPS50c對雞T淋巴細(xì)胞增殖及白細(xì)胞介素-2(IL-2)mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，多糖單獨(dú)加入到外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，sTPS70c和sCPPS50c幾乎所有濃度均可顯著刺激T淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05)，而TPStp僅在濃度為3.125 μg/mL時(shí)顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)；多糖與植物血凝素P(PHA-P)同時(shí)加入到外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，sCPPS50c在濃度為0.391～1.563 μg/mL時(shí)顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)；sTPS70c和sCPPS50c在濃度為1.563 μg/mL時(shí)可提高T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，其中sTPS70c對IL-2 mRNA的促表達(dá)作用顯著強(qiáng)于TPStp(P<0.05)，且在濃度為1.563 μg/mL時(shí)的作用最強(qiáng)。結(jié)果提示，硫酸化修飾可以提高多糖的淋巴細(xì)胞增殖活性及顯著增強(qiáng)IL-2 mRNA的表達(dá)，且以sTPS70c的作用較強(qiáng)，這與取代度有一定的相關(guān)性。

硫酸化銀耳多糖；硫酸化黨參多糖；淋巴細(xì)胞增殖；白細(xì)胞介素-2

硫酸化修飾可以進(jìn)一步提高多糖的生物活性，并能產(chǎn)生許多新的藥用價(jià)值，尤其是賦予或增強(qiáng)多糖的抗病毒和免疫活性，因此倍受關(guān)注。硫酸化多糖可通過多途徑、多層面發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。研究證明，硫酸化多糖主要通過激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌等方式和途徑來實(shí)現(xiàn)對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[1-3]。

白細(xì)胞介素-2(IL-2)是T淋巴細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能促使B淋巴細(xì)胞分化和分泌抗體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，提高單核細(xì)胞以及NK細(xì)胞的活性，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[4-5]。因此，在前期研究[6-7]的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步了解硫酸化多糖增強(qiáng)免疫作用及探討其作用機(jī)理，本試驗(yàn)采用噻唑藍(lán)(MTT)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定硫酸化銀耳多糖(sTPS70c)和硫酸化黨參多糖(sCPPS50c)對雞T淋巴細(xì)胞增殖及IL-2 mRNA表達(dá)水平的影響，研究sTPS70c和sCPPS50c的免疫增強(qiáng)作用并篩選出1種免疫活性較強(qiáng)的硫酸化多糖。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；植物血凝素P(PHA-P)購自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液為上海華精生物科技發(fā)展公司產(chǎn)品；二甲亞砜(DMSO)購自天津科密歐化學(xué)試劑公司；RNAiso Plus、Taq酶、5×Taq buffer和2.5 mmol/L氯化鎂(MgCl2)試劑均購自TaKaRa公司；DEPC水為南京壽康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SYBR Green Ⅰ Master Mix購自日本Toyobo公司；10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)購自上海捷倍思生物技術(shù)有限公司；IL-2和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)；DNA Marker和離心柱型PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)藥物

sTPS70c、sCPPS50c和未修飾銀耳多糖(TPStp)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)研究室提供。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，sTPS70c、sCPPS50c和TPStp分別用無小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成6.250、3.125、1.563、0.782和0.391 μg/mL 5個(gè)濃度，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雞T淋巴細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

成年公雞無菌心臟采血(肝素抗凝)30 mL，Hank’s液稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞，Hank’s液洗滌，1 500 r/min離心10 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106個(gè)/mL，每孔80 μL細(xì)胞液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后加入各濃度的sTPS70c、sCPPS50c和TPStp100 μL，重復(fù)4孔，另加入終濃度為20 μg/mL PHA-P，并設(shè)多糖對照、細(xì)胞對照和PHA-P對照。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加DMSO 100 μL，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定A570值，檢測T淋巴細(xì)胞增殖能力[7-8]。

1.4 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp對雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平的測定

1.4.1 雞T淋巴細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

分離方法同1.3。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，每孔800 μL細(xì)胞液加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)加入1.563～6.250 μg/mL的sTPS70c、sCPPS50c和TPStp各1 mL，然后加入200 μL PHA-P溶液(20 μg/mL)，另設(shè)細(xì)胞對照和PHA-P對照，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞于1.5 mL Eppendorf管，低溫冷凍離心機(jī)中2 000 r/m離心10 min。棄上清，加1 mL磷酸緩沖液(PBS)混勻后再離心10 min。棄上清，-70 ℃保存，提取RNA備用。

1.4.2 雞T淋巴細(xì)胞總RNA的提取

各Eppendorf管加入1 mL Trizol，振蕩混勻后，室溫放置10 min；向每管中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置10 min；12 000 r/min低溫離心15 min，取上清350 μL，加入等體積異丙醇，混勻，4 ℃放置20 min，然后12 000 r/min低溫離心15 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，棄上清，RNA沉淀室溫干燥。用20 μL 0.1 % DEPC水溶解，-20 ℃凍存[9-10]。

1.4.3 反轉(zhuǎn)錄

以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上雞IL-2(序列號：AJ224516.1)和GAPDH(序列號：NM204305)的RNA序列，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成引物。分別擴(kuò)增IL-2和GAPDH的138和146 bp片段[11]。

IL-2(138 bp)：上游，5′-AGGGGTGAATTCACAAGGG-3′；下游，5′-ACTTCTCCCAGGTAACAC-3′。

GAPDH(146 bp)：上游，5′-TGGAGAAACCAGCCAAGTAT-3′；下游，5′-CGCATCAAAGGTGGAAGAAT-3′。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測定

反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green Ⅰ Master Mix，0.6 μL上游引物，0.6 μL下游引物，2 μL cDNA，加三蒸水定容至體積20 μL[12]。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，特異退火溫度30 s采集熒光信號，40個(gè)循環(huán)；并自60 ℃緩慢升溫至99 ℃后分析熔解曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用比較Ct值法[13]，分別計(jì)算各樣品中IL-2 mRNA相對表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 16.0進(jìn)行Duncan氏多重分析，比較各多糖作用下T淋巴細(xì)胞中IL-2的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp對雞T淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 多糖單獨(dú)作用對雞T淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，sCPPS50c在濃度為0.391～6.250 μg/mL、sTPS70c在濃度為0.782～6.250 μg/mL以及TPStp在濃度為3.125 μg/mL時(shí)的A570值與細(xì)胞對照相比差異顯著(P<0.05)，顯著高于細(xì)胞對照。sTPS70c和sCPPS50c的硫酸基取代度分別為1.62和1.36，表明它們在相應(yīng)濃度明顯促進(jìn)雞T淋巴細(xì)胞增殖的效果強(qiáng)于未修飾多糖，且與硫酸基取代度有關(guān)。

表1 多糖單獨(dú)作用對雞T淋巴細(xì)胞增殖的的影響Table 1 Effects of polysaccharides alone on proliferation of the T lymphocyte of broilers

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.1.2 多糖協(xié)同PHA-P作用對雞T淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，sCPPS50c在濃度為0.391～1.563 μg/mL時(shí)的A570值顯著高于PHA-P對照(P<0.05)，表明其在相應(yīng)濃度能協(xié)同PHA-P作用顯著促進(jìn)雞T淋巴細(xì)胞增殖。

表2 多糖協(xié)同PHA-P作用對雞T淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of polysaccharides cooperated with PHA-P on proliferation of T lymphocyte of broilers

2.2 雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

樣本的擴(kuò)增曲線為“S”形，擴(kuò)增曲線之間間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差值<0.1，說明PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率相對一致(圖1)。溶解曲線分析表明，峰值單一，說明無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出現(xiàn)(圖2)。

2.2.2 sTPS70c、sCPPS50c和TPStp對雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平的影響

設(shè)PHA-P對照的2-△△Ct為1，與PHA-P對照比較，sTPS70c在濃度為1.563～6.250 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平分別為1.87、2.26和8.13；sCPPS50c在濃度為1.563～3.125 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平分別為1.80和3.32；TPStp在濃度為1.563和6.250 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平分別為1.52和1.83，表明各多糖均可以促進(jìn)IL-2 mRNA的表達(dá)。

由圖3可知，sTPS70c和sCPPS50c在濃度為1.563 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平與PHA-P對照相比差異顯著(P<0.05)，sTPS70c在濃度為1.563 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平與TPStp差異顯著(P<0.05)；sTPS70c在濃度為6.250 μg/mL、sTPS70c和sCPPS50c在濃度為3.125 μg/mL時(shí)雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)水平高于TPStp，但差異不顯著(P>0.05)，sTPS70c在濃度為1.563 μg/mL雞T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)最強(qiáng)，且硫酸基取代度較高。

圖1 樣本擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Sample amplification curve and standard curve

圖2 樣本溶解曲線Fig.2 Sample dissolution curve

柱形標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Columns with different letter subscripts mean significant difference (P<0.05).

圖3IL-2 mRNA表達(dá)水平

Fig.3IL-2 mRNA expression level

3 討 論

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖單獨(dú)刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)，sTPS70c和sCPPS50c幾乎所有濃度、TPStp僅在濃度為3.125 μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；多糖與PHA-P共同作用T淋巴細(xì)胞時(shí)，sCPPS50c在濃度為1.563 μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；這表明硫酸化修飾后可以增強(qiáng)多糖的免疫活性。未經(jīng)PHA-P刺激的淋巴細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)于多糖與PHA-P協(xié)同作用，說明硫酸化多糖能單獨(dú)刺激淋巴細(xì)胞增殖，且效果強(qiáng)于絲裂原。Nguyen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化黑木耳多糖sAAP1和sAAPt能單獨(dú)或協(xié)同PHA-P促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增殖作用，硫酸化修飾可以顯著提高細(xì)胞免疫作用。

多糖的硫酸基取代度與其增強(qiáng)免疫活性也有很大的關(guān)系。sTPS70c和sCPPS50c的硫酸基取代度分別為1.62和1.36，發(fā)現(xiàn)它們促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的作用與較高的硫酸基取代度有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化當(dāng)歸多糖促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用與其硫酸基取代度有一定的關(guān)系，取代度越高，作用越強(qiáng)[16]，這與本研究結(jié)果一致?？赡苁橇蛩峄揎椇蠖嗵钱a(chǎn)生了新的結(jié)構(gòu)，引起了多糖理化性質(zhì)和立體構(gòu)象的變化，從而顯著提高了多糖的生物活性。

IL-2能激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖與免疫效應(yīng)，在細(xì)胞免疫中是免疫調(diào)節(jié)作用的核心[17]。因此，通過分析IL-2 mRNA的表達(dá)水平，可以對外周血中T淋巴細(xì)胞的活化程度進(jìn)行初步評價(jià)，并反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2種硫酸化多糖sTPS70c和sCPPS50c均在濃度為1.563 μg/mL時(shí)IL-2 mRNA表達(dá)水平與PHA-P對照差異顯著，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)，但2種硫酸化多糖的表達(dá)水平有顯著差異，sTPS70c在濃度為1.563 μg/mL時(shí)IL-2 mRNA表達(dá)水平與TPStp相比差異顯著，可以顯著促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞中IL-2 mRNA的表達(dá)，表達(dá)最為豐富，從而促進(jìn)IL-2的分泌，發(fā)揮增強(qiáng)免疫作用。有研究表明黃芪多糖對犬脾淋巴細(xì)胞IL-2、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用，且IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平顯著優(yōu)于刀豆素A(ConA)[19]。

4 結(jié) 論

sTPS70c和sCPPS50c均可以提高多糖的淋巴細(xì)胞增殖活性并顯著增強(qiáng)IL-2 mRNA的表達(dá)，且以sTPS70c的作用較強(qiáng)，可作為潛在的免疫增強(qiáng)劑開發(fā)利用。

致謝：

感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院趙曉娜博士對文稿所提的寶貴意見。

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*Corresponding author, professor, E-mail: ylhu@njau.edu.cn

(責(zé)任編輯 田艷明)

Effect of Sulfated Polysaccharidses fromTremellaandCondonpsispilosulaon T Lymphocyte Proliferation and mRNA Expression Level of Interleukin-2 of Broilers

ZHU Guangshuang1HU Yuanliang2*CAO Kan1WANG Benzhong1

(1.CollegeofBiologicalEngineering,WuhuInstituteofTechnology,Wuhu241003,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

In order to study the mechanism of sulfated polysaccharidses fromTremella(sTPS70c) andCondonpsispilosula(sCPPS50c) on immunological enhancement activity, the effects of sTPS70cand sCPPS50con T lymphocyte proliferation and the mRNA expression level of interleukin-2 (IL-2) were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and real-time fluorescent quantitative PCR assay while taking the unmodified polysaccharidses fromTremella(TPStp) as control. The results showed that in single adding into peripheral lymphocyte, sTPS70cand sCPPS50calmost at all concentrations and TPStp only at 3.125 μg/mL could significantly stimulate T lymphocyte proliferation (P<0.05). In simultaneous adding into peripheral lymphocyte with plant haemagglutinin P (PHA-P), sCPPS50cat 0.391 to 1.563 μg/mL significantly stimulated T lymphocyte proliferation (P<0.05). sTPS70cand sCPPS50calso could significantly promote mRNA expression level ofIL-2 in T lymphocyte at 1.563 μg/mL (P<0.05), and the promoting effects of sTPS70cwere significantly better than TPStp(P<0.05), especially at 1.563 μg/mL, the effect of sTPS70cwas the strongest. These results indicate that sulfated modification can enhance the lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2, and sTPS70cpresents more stronger action, which is related to the degree of substitution at a centain extent.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(7)：2535-2540]

sulfatedTremellapolysaccharide; sulfatedCodonopsispilosulapolysaccharide; lymphocyte proliferation; interleukin-2

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.07.038

2017-03-23

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2017A564)；安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A401)；校級自然科學(xué)研究項(xiàng)目“應(yīng)用復(fù)方中草藥防治豬場常見呼吸道疾病的研究”(wzyzr201619)；校級“教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程”項(xiàng)目(2016)

朱廣雙(1975—)，男，安徽蕪湖人，講師，碩士，研究方向?yàn)橹蝎F醫(yī)學(xué)。E-mail: 627990977@qq.com

*通信作者:胡元亮，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： ylhu@njau.edu.cn

S831

A

1006-267X(2017)07-2535-06