周 巍 周 劍

(1.合肥市第二人民醫(yī)院口腔科，安徽 合肥 230011；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 230032)

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骨保護(hù)素轉(zhuǎn)染犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞與聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物材料的體外生物相容性

周 巍1周 劍2

(1.合肥市第二人民醫(yī)院口腔科，安徽 合肥 230011；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 230032)

目的 觀察骨保護(hù)素(osteoprotegerin ，OPG)轉(zhuǎn)染Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells ，BMSCs)與牙周組織工程技術(shù)相結(jié)合的可行性。方法 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)真核質(zhì)粒載體pSecTag2/B-opg轉(zhuǎn)染Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞12h，熒光免疫化學(xué)鑒定OPG蛋白表達(dá)效率，BMSCs與聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物共培養(yǎng)4h，倒置相差顯微鏡及掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架上的粘附、生長情況。結(jié)果 熒光免疫化學(xué)證實(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的OPG較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組表達(dá)明顯增高(P<0.05)，相差倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察可見轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在PLGA支架上的粘附、生長良好。結(jié)論 OPG轉(zhuǎn)染的BMSCs (BMSCsOPG)作為一種新型的種子細(xì)胞，其與PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)可以用于牙周組織工程的研究。

骨保護(hù)素；基因治療；牙周缺損

牙周病是以牙周支持組織破壞為特征的慢性感染性疾病，是造成牙齒脫落的主要原因之一[1]。骨是不斷變化的組織，骨吸收與骨重建是不斷循環(huán)的過程。關(guān)于骨吸收的研究發(fā)現(xiàn)，RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是主要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。核因子κB受體活化因子(RANKL)屬于成骨細(xì)胞分泌的眾多細(xì)胞因子的其中一種，它與破骨細(xì)胞膜上對應(yīng)受體結(jié)合，可以刺激破骨細(xì)胞活力，從而促進(jìn)骨的吸收。同時(shí)成骨細(xì)胞也會(huì)分泌骨保護(hù)素(OPG)，一種腫瘤壞死因子受體，來抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟[2，3]。由此設(shè)想，通過增加牙周局部OPG蛋白的表達(dá)量來減少破骨細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到促進(jìn)牙周組織再生的目的。本實(shí)驗(yàn)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)真核質(zhì)粒pEGFP-opg轉(zhuǎn)染Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞。觀察轉(zhuǎn)染后OPG蛋白的表達(dá)效率以及細(xì)胞與PLGA支架的生物相容性情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料、儀器 重組真核質(zhì)粒pSecTag2/B-opg由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ購自大連生物公司；提取試劑盒購自美國Promega公司；Opti-MEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自四季青公司；；Lipofectamin2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；OPG抗體、β-actin抗體、熒光二抗購自美國博奧森公司；聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(PLGA)購自山東醫(yī)療器械公司；顯色試劑盒購自美國Pierce公司；熒光倒置顯微鏡顯微鏡日本Olympus公司；REVCO ELITE Ⅱ型CO2培養(yǎng)箱美國Asheville 公司、高速低溫離心機(jī)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將Beagle犬靜脈全麻(2%戊巴比妥鈉，1ml/kg)，待麻醉效果良好后，于髂骨穿刺，套管抽取骨髓2～3ml，投入PBS緩沖液中立即送無菌室，在超凈工作臺(tái)上，骨髓由紅細(xì)胞裂解液處理，低速離心5min后培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，吹打均勻后放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2,95%O2。第2d首次換液，以后每2～3d換液。待細(xì)胞局部密集成片時(shí)，加入胰蛋白酶消化液消化分散。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底70～80%時(shí)，按1：2消化傳代細(xì)胞。每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化及貼壁情況，采集影像資料。

1.2.2 OPG基因轉(zhuǎn)染BMSCs及免疫熒光化學(xué)鑒定OPG表達(dá)水平轉(zhuǎn)染前24h將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用脂質(zhì)體Lipofectamine分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSecTag2/B-opg和空質(zhì)粒pSecTag2/B于beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞，標(biāo)記為OPG組和空白對照組。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率約在50%-60%，轉(zhuǎn)染方法參照PureYield Plasmid Midiprep System 。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1.2。轉(zhuǎn)染后12h，用免疫熒光化學(xué)鑒定OPG蛋白在OPG組和空白對照組中的表達(dá)。

1.2.3 OPG轉(zhuǎn)染的 骨髓基質(zhì)細(xì)胞與PLGA細(xì)胞支架的體外構(gòu)建及鑒定制作PLGA支架：分子量為60000，孔徑300um～400um，孔隙率95%以上，5mm ×5 mm ×5 mm 大小。環(huán)氧乙烷滅菌，備用。調(diào)整OPG組和空白對照組細(xì)胞為106 /ml，分別于支架共培養(yǎng)4h后，相差倒置顯微鏡觀察并采集影像資料。繼續(xù)培養(yǎng)1d后，3%戊二醛固定1d，在掃描電鏡下觀察并采集影像資料。

2 結(jié)果

2.1 Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長情況及形態(tài)學(xué)特征 培養(yǎng)4～6天，可見貼壁的BMSCs呈集落狀生長。傳代后，細(xì)胞變細(xì)變長，呈柵欄狀排列，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，10d左右鋪滿培養(yǎng)瓶底80%。見圖1

圖1 首次換液后細(xì)胞形態(tài)(圖1，A)傳代后，細(xì)胞形態(tài)(圖1，B)(100 ×)

2.2 轉(zhuǎn)染pSecTag/B-opg后，熒光免疫化學(xué)檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OPG蛋白的水平 在OPG組和空白對照組中分別隨機(jī)選取五個(gè)視野，用JEDA 形態(tài)學(xué)分析軟件分別測量兩組的平均染色灰度值分別為(21.8960±1.2435)和(11.8711±1.8221)，兩樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。見圖2

圖2

圖2轉(zhuǎn)染12h后，細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定OPG蛋白表達(dá)。A1-A3：OPG組；B1-B3:空白對照組。A1和B1:兔抗OPG陽性細(xì)胞(紅)；A2和B2:DAPⅠ染色后細(xì)胞(藍(lán))；A3和B3：疊加后的圖像。(200 ×)

2.3 細(xì)胞支架復(fù)合物體外構(gòu)建后的觀察結(jié)果 細(xì)胞與支架共培養(yǎng)4h后,在顯微鏡下，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在支架內(nèi)部及表面伸展良好，周圍的培養(yǎng)液中罕見細(xì)胞；掃描電鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在材料孔洞、表面中呈卵圓形附著，同時(shí)可見細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。觀察結(jié)果顯示OPG轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對PLGA有著良好的適應(yīng)性。見圖3，圖4

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞與支架共培養(yǎng)4h后相差倒置顯微鏡照片(100 ×)

圖4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞與支架共培養(yǎng)1天后掃描電鏡照片

3 討論

3.1 在牙周組織工程研究中，種子細(xì)胞和支架材料都是至關(guān)重要的組成部分。目前作為種子細(xì)胞，可考慮應(yīng)用于牙周組織再生的，主要有牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)、骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)、胚胎干細(xì)胞等。PDLCs直接來自牙周組織，有很強(qiáng)的分化增殖能力，而常被選用牙周組織工程的種子細(xì)胞，但PDLCs的來源非常有限，同時(shí)PDLCs的培養(yǎng)和分化也很困難。[4]現(xiàn)在越來越多的學(xué)者開始考慮BMSCs作為骨組織工程的種子細(xì)胞來源，其優(yōu)點(diǎn)有：來源廣泛，數(shù)量充足，(1)取材方便，機(jī)體損傷小，易于臨床操作；(2)具有貼壁生長的特性，體外培養(yǎng)時(shí)增殖能力強(qiáng)，易穩(wěn)定表達(dá)成骨細(xì)胞表型；(3)具有多向分化能力，可以分化為骨、軟骨等多種中胚層組織；(4)無免疫原性。因而BMSCs可能成為牙周組織工程中理想的種子細(xì)胞。

3.2 OPG屬于腫瘤壞死因子受體超家族的新成員，是一種成骨細(xì)胞分泌的無跨膜結(jié)構(gòu)的可溶性糖蛋白，通過與RANKL結(jié)合，可以達(dá)到抑制RANKL/RANK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制破骨細(xì)胞形成。OPG具有調(diào)節(jié)骨密度的作用[5]。很多研究表明，RANKL的過表達(dá)，不僅可以導(dǎo)致一系列骨疾病的發(fā)生，還可以導(dǎo)致牙周組織的破壞[6，7]，通過檢測牙周病患者的齦溝液，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RANKL/OPG的比率明顯升高，細(xì)菌產(chǎn)生的很多炎癥介質(zhì)也有顯著升高[8]。骨改建是舊骨不斷吸收，新骨不斷形成的過程，體現(xiàn)了骨對于環(huán)境的適應(yīng)。許多研究證實(shí)，RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在骨代謝中是重要的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。我們利用真核分泌表達(dá)穿梭載體pSecTag2/B-opg瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Beagle犬BMSCs，獲得了高表達(dá)OPG蛋白的Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使得這一理想的種子細(xì)胞變得更加符合牙周組織工程的要求，為后期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)。

3.3 醫(yī)學(xué)生物支架材料的金標(biāo)準(zhǔn) (1)良好的生物相容性；(2)可以設(shè)計(jì)的降解時(shí)間，能夠?yàn)樾陆M織逐步提供物理空間；(3)在人體微環(huán)境中保持良好的空間形態(tài)和機(jī)械性能[9]。我們在PLGA支架上可以看到BMSCs的粘附，鋪展和增殖，說明此材料的微環(huán)境具有良好的生物相容性。PLGA是無毒的生物降解性聚合物，該聚合物在體內(nèi)可逐步降解為乳酸和羥基乙酸，參與新陳代謝，最終降解為二氧化碳和水后被排除體外，不留副產(chǎn)物，對人體無害。不同的單體比例可以制備出不同性能的聚合物，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的PLGA 50/50表示該聚合物由50%乳酸和50%羥基乙酸組成。PLGA還具有良好的成囊和成膜的性能，其結(jié)晶度可控，由此調(diào)節(jié)聚合物的可溶解性，可以通過調(diào)整單體比，進(jìn)而改變PLGA的降解時(shí)間[10]。根據(jù)在牙周環(huán)境6-8周降解，同時(shí)能夠形成礦化骨的設(shè)想，我們要求制作的PLGA50/50分子量為60000，孔徑300um-400um,孔隙率95%。

因此，OPG基因修飾的BMSCs作為一種新型的種子細(xì)胞，其與PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)可以用于進(jìn)一步的牙周組織工程研究。

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The empirical study on compound of polyactide-co-glycolide and bone marrow stromal cells modified by osteoprotegerin gene in vitro

Zhou Wei1Zhou Jian2

(1.Departement of Stomatology,the Second People’s Hospital of Hefei,Hefei 230011,Anhui,China
2.Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

Objective To investigate the compound situation when bone marrow stromal cells(BMSCs) modified by osteoprotegerin gene and polyactide-co-glycolide(PLGA) material co-culture in vitro,and verify the feasibility of BMSCs modified by osteoprotegerin gene as seed cells of periodontal tissue engineering. Method Bone marrow stromal cells(BMSCs) was transfected with pSecTag2/B-opg by means of lipofectamine media methods.After transferring 12h，the expression of OPG protein in the bone marrow stromal cells detected by immunocytochemistry. Inverted phase contrast microscope and scanning electron microscopy were used to observe the proliferation of the cells transfected in the PLGA. Result The expression of OPG protein was detected in 12h after transferring.Inverted phase contrast microscope and scanning electron microscopy demonstrated that BMSCsOPG were able to proliferate and massively colonize on the scaffolds structure. Conclusion The PLGA material is a good bearer for BMSCsOPG.Gene therapy utilizing OPG may offer the potential for periodontal tissue engineering applications.

osteoprotegerin(OPG); gene therapy; periodontal defect

10.3969/j.issn.2095-9559.2017.03.062

2095—9559(2017)03—3125—03

2016-11-08