姚俠妹，常二梅，紀(jì) 敬，岳劍云，謝田田，鄧 楠， 史勝青，江澤平*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

外源ABA對短期H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗活性氧代謝及相關(guān)基因的影響

姚俠妹1, 2，常二梅1，紀(jì) 敬1，岳劍云1，謝田田1，鄧 楠1， 史勝青1，江澤平1*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

[目的]研究外源ABA 處理對H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗活性氧代謝系統(tǒng)的影響，探討ABA調(diào)控側(cè)柏氧化脅迫的可能作用機(jī)制。[方法] 以側(cè)柏幼苗為試驗(yàn)材料，采用水培方式，研究外施低濃度(0.5 μmol·L-1)和高濃度(200 μmol·L-1)ABA對100 mmol·L-1H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗活性氧代謝的影響。[結(jié)果](1)100 mmol·L-1H2O2脅迫48 h 顯著增加了側(cè)柏幼苗葉片過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸含量、抗氧化物酶(SOD和CAT)活性，而可溶性蛋白含量降低。(2)相較于高濃度200 μmol·L-1ABA，施加0.5 μmol·L-1ABA顯著減少了H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗H2O2和MDA的積累，進(jìn)一步提高了側(cè)柏幼苗葉片SOD、POD和CAT活性，同時促進(jìn)GSH、脯氨酸和可溶性蛋白的合成。(3)100 mmol·L-1H2O2脅迫處理48 h，側(cè)柏幼苗葉片活性氧代謝相關(guān)基因Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST表達(dá)水平較對照CK均有顯著性提高；正常和H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗外施0.5 μmol·L-1ABA相較于200 μmol·L-1更有利于提高側(cè)柏葉片活性氧代謝相關(guān)基因Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST的表達(dá)量。[結(jié)論] 低濃度0.5 μmol·L-1ABA有效地增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)的防御能力，減弱幼苗的氧化脅迫和膜脂過氧化水平，從而降低活性氧對側(cè)柏的傷害。

側(cè)柏；H2O2脅迫；ABA；活性氧代謝；基因表達(dá)

植物經(jīng)常暴露于各種環(huán)境(如干旱、鹽堿、重金屬等)脅迫中，嚴(yán)重影響了它們的酶和非酶成分，還對它們的相關(guān)基因構(gòu)成威脅，且減緩了同化系統(tǒng)建成速度，影響生長進(jìn)程?；钚匝?ROS)在調(diào)節(jié)各種生物現(xiàn)象中起著重要的作用，包括激活細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及由此引起的基因表達(dá)。持續(xù)暴露于ROS中會引起植物的氧化脅迫，影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。非生物脅迫可導(dǎo)致細(xì)胞ROS濃度增加，隨后轉(zhuǎn)化為H2O2，它能夠跨膜自由擴(kuò)散，當(dāng)其在細(xì)胞中的濃度積累到一定程度時，就會造成細(xì)胞損傷。同樣，H2O2也可作為信號分子參與到脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[1]。此外，活性氧不足可以引起細(xì)胞氧化脅迫，影響基因組的穩(wěn)定性[2]，因此氧化脅迫是細(xì)胞損傷的重要原因。蔣景龍等[3]施加不同濃度H2O2處理7 d苗齡的山黧豆幼苗24 h，分析山黧豆根系受氧化脅迫的程度與抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制，結(jié)果表明，H2O2的積累與其受氧化脅迫程度呈正相關(guān)，且低濃度處理可以提高山黧豆抗氧化性能。Wan等[4]通過對12 d苗齡的水稻進(jìn)行不同梯度H2O2處理6 h，分析葉片生理生化響應(yīng)，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了水稻葉片生理特征變化與其脅迫響應(yīng)蛋白之間的關(guān)系。

脫落酸(ABA)在植物非生物脅迫中起關(guān)鍵作用，它是激發(fā)植物應(yīng)對不利環(huán)境條件的重要信號[5-6]，并且能夠協(xié)同調(diào)節(jié)脅迫反應(yīng)中多種生理功能，包括氣孔閉合，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和誘導(dǎo)脅迫相關(guān)蛋白的合成，如熱休克蛋白，ROS清除劑等。然而，雖然許多非生物脅迫誘導(dǎo)基因受ABA控制，但有一些不是，這表明ABA依賴和非依賴性途徑共同參與脅迫信號的傳導(dǎo)[7-8]。ABA也是長距離信號分子，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化時，它能夠從成熟葉片持續(xù)地傳輸?shù)桨l(fā)育葉片[9]。脅迫引起H2O2含量增加，造成氧化脅迫，而施加外源ABA，通過其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，從而提高植物抗性[10-11]。Desikan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，施加外源ABA有利于氧化脅迫下植物的適應(yīng)生長，增加抗氧化酶的活性并誘導(dǎo)ROS清除系統(tǒng)等相關(guān)基因表達(dá)。王允等[13]研究表明，ABA可通過提高姜葉片ROS抗氧化系統(tǒng)的酶和非酶成分以抵御干旱引起的氧化脅迫。另外，研究顯示外源物的調(diào)控效果與植物種類以及施用的方法、時間和濃度關(guān)系緊密[14,15]。側(cè)柏(Platycladusorientalis(Linn.) Franca)資源豐富，是生態(tài)環(huán)境修復(fù)的主要造林樹種，具有一定的耐寒、耐旱、抗鹽堿等特性，廣泛分布于我國各地區(qū)，是我國特色樹種，目前關(guān)于外源ABA與側(cè)柏氧化脅迫交互作用的研究尚無報(bào)道。本試驗(yàn)研究了氧化脅迫下側(cè)柏活性氧代謝以及施加外源ABA對其產(chǎn)生的作用，以期從生理生化和分子方面探討側(cè)柏的抗氧化脅迫和ABA的調(diào)控機(jī)制，為其更好地推廣利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)是在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，于2016年在中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。以側(cè)柏幼苗為試材，其種子采集于中國林業(yè)科學(xué)研究院院內(nèi)，經(jīng)浸種處理后，于2016年1月播種于塑料穴盆中，待生長至4月下旬，選擇生長一致的植株，將其沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至含有1/4 Hoagland溶液(pH 6.0)容器(10 L，60株/容器)中培育兩周，待幼苗恢復(fù)正常生長，對側(cè)柏進(jìn)行試驗(yàn)處理。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇100 mmol·L-1H2O2為脅迫處理濃度。試驗(yàn)處理具體如下：CK(1/4 Hoagland溶液)、CK+ABA0.5(0.5 μmol·L-1ABA+1/4 Hoagland溶液)、CK+ABA200(200 μmol·L-1ABA+1/4 Hoagland溶液)、H2O2(100 mmol·L-1H2O2+1/4 Hoagland溶液)、H2O2+ABA0.5(0.5 μmol·L-1ABA+100 mmol·L-1H2O2+1/4 Hoagland溶液)、H2O2+ABA 200(200 μmol·L-1ABA+100 mmol·L-1H2O2+1/4 Hoagland溶液)。以上實(shí)驗(yàn)每處理3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)20株。所有植株處理6和48 h后取樣，且進(jìn)行液氮快速冷凍并存儲在-80°C，為后續(xù)RNA提取和生理指標(biāo)測定分析做準(zhǔn)備。

1.2 生理指標(biāo)測定

H2O2含量測定采用四氯化鈦沉淀法[16]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法[17]；SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[18]；POD活性測定方法參照Cakmak和Marschner[19]；CAT活性測定方法參照J(rèn)ablonski和Anderson[20]方法；GSH含量測定方法參照Anderson[21]；Proline含量測定采用茚三酮比色法[22]；可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法[23]。

1.3 實(shí)時熒光定量qRT-PCR檢測活性氧相關(guān)基因的表達(dá)量

采用植物RNA提取試劑盒(Tiandz)提取側(cè)柏葉片的總RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)側(cè)柏轉(zhuǎn)錄組的注釋Unigene，采用Primer Premier 3.0軟件進(jìn)行側(cè)柏活性氧代謝相關(guān)基因定量引物設(shè)計(jì)，引物擴(kuò)增效率均在95%～105%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在100～150 bp，引物序列見表1，αTUB為側(cè)柏內(nèi)參基因[24]，相對表達(dá)量使用2-ΔΔCT方法[25]，3個生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定在Roche LightCycler?480進(jìn)行，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Takara)試劑盒。PCR反應(yīng)體系(20 μL)含有10 μL SYBR? primer Ex Taq(2×)，每條引物0.8 μL(10 μmol·L-1)，cDNA稀釋13倍，取2.0 μL和6.4 μL蒸餾水。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 s；95°C變性15 s，60°C退火30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物熒光值變化和熔解曲線進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

表1 活性氧代謝相關(guān)基因引物

利用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，采用One-Way ANOVA進(jìn)行比較。各處理之間的顯著性差異檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA對側(cè)柏葉片H2O2和MDA含量的影響

圖1a顯示，正常條件下側(cè)柏外施0.5和200 μmol·L-1濃度的ABA，其葉片H2O2含量于6 h分別較對照CK降低27.73 %和2.91 %，處理48 h，分別降低22.16 %和6.74 %；側(cè)柏幼苗響應(yīng)100 mmol·L-1H2O2脅迫，其葉片H2O2含量于6和48 h分別較對照CK顯著提高22.85 %和43.78 %，且在0～48 h內(nèi)，隨著脅迫時間延長，其含量逐步增加。施加不同濃度ABA對葉片H2O2積累產(chǎn)生不同的效應(yīng)。H2O2+0.5ABA處理于6 h降低脅迫葉片H2O2水平的13.61 %，而H2O2+200ABA則是提高了4.68 %且與H2O2處理差異顯著(P<0.05)，處理至48 h，H2O2+0.5ABA和H2O2+200ABA分別降低20.81 %和12.37 %。由此可知，相較于施加高濃度200 μmol·L-1ABA，H2O2脅迫外施低濃度0.5 μmol·L-1ABA更有利于降低H2O2的快速生成。

MDA含量反映脅迫引起的氧化脅迫程度。正常條件下側(cè)柏外施0.5和200 μmol·L-1ABA處理6和48 h，其葉片MDA含量較對照CK均顯著降低(P<0.05)；側(cè)柏小苗H2O2脅迫6和48 h，葉片MDA含量相較于CK分別提高了30.41 %和69.84 %(圖1b)，6和48 h處理間葉片MDA含量差異顯著(P<0.05)。H2O2+0.5ABA和H2O2+200ABA處理側(cè)柏幼苗6 h，前者顯著降低了MDA含量，幅度為H2O2脅迫的6.02 %，而后者與H2O2處理差異不顯著(P>0.05)。隨著處理時間延長至48 h，H2O2+0.5ABA和H2O2+200ABA處理均能顯著降低脅迫側(cè)柏葉片MDA含量，前者的緩解效果明顯高于后者，降幅分別為H2O2脅迫的39.51 %和14.34 %(P<0.05)(圖1b)。

注：不同小寫字母代表各處理間在0.05水平存在顯著性差異；數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；下同。Note: Different small letters mean significant difference among treatments (P<0.05); Data are mean ± SD (n=3); The same as below.圖1 ABA對H2O2脅迫下側(cè)柏葉片H2O2和MDA含量的影響Fig. 1 Effects of ABA on H2O2 and MDA contents of P. orientalis under H2O2 stress

2.2 外源ABA對側(cè)柏葉片抗氧化物酶和GSH含量的影響

通過測定側(cè)柏幼苗葉片SOD、POD和CAT活性，從而評估ABA對側(cè)柏幼苗的抗氧化酶活性的影響，結(jié)果見圖2a～c。100 mmol·L-1H2O2脅迫處理6 h提高了SOD活性，相較于CK提高10.01 %，但差異不顯著(P>0.05)；之后這種上升趨勢持續(xù)到48 h，顯著提高了36.80 %，由此可知，側(cè)柏在0～48 h脅迫過程中，其SOD活性是逐步升高的。正常條件下，0.5和200 μmol·L-1ABA處理側(cè)柏6和48 h均可顯著提高SOD活性；而在H2O2脅迫條件下施加不同濃度ABA處理48 h，側(cè)柏葉片SOD活性產(chǎn)生不同的響應(yīng)。H2O2+0.5ABA處理顯著提高了脅迫葉片的SOD活性，幅度為12.30 %，而H2O2+200ABA處理相較于H2O2脅迫葉片降低了28.57 %。100 mmol·L-1H2O2處理6和48 h導(dǎo)致側(cè)柏葉片POD活性較對照CK下降，且6 h時兩者之間差異顯著(P<0.05)。正常條件外施ABA對POD活性的影響與SOD活性類似。H2O2+0.5ABA和H2O2+200ABA處理48 h均顯著增加了脅迫葉片的POD活性(P<0.05)，但兩者之間差異顯著，低濃度(0.5 μmol·L-1)ABA提高了97.49 %，而高濃度(200 μmol·L-1)則增加了25.60 %。CAT活性在100 mmol·L-1H2O2處理6和48 h后分別較對照CK上升了17.04 %和30.78 %，H2O2+0.5ABA處理較H2O2+200ABA能明顯提高葉片CAT活性，6和48 h后分別較對照CK上升了29.40 %和8.80 %。通過以上分析說明，低濃度0.5 μmol·L-1ABA明顯提高脅迫條件下側(cè)柏葉片抗氧化酶活性，更有利于維持葉片活性氧產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡。

圖2d顯示，側(cè)柏在正常條件下外施0.5和200 μmol·L-1ABA，其GSH含量于6 h分別較對照CK顯著增加了16.10 % 和9.59 %，之后這種趨勢繼續(xù)，至48 h，分別顯著提高26.67 %和16.05 %；側(cè)柏葉片GSH含量經(jīng)單一100 mmol·L-1H2O2處理后增加，分別較對照CK提高了46.94 %和35.27 %，且6 h高于48 h，隨時間的延長有降低的趨勢。而外施0.5和200 μmol·L-1ABA處理48 h在一定程度上致使H2O2脅迫的側(cè)柏葉片GSH含量產(chǎn)生不同響應(yīng)，H2O2+0.5ABA處理進(jìn)一步提高了脅迫葉片GSH含量，H2O2+200ABA處理相較于H2O2脅迫則抑制了GSH的合成。

2.3 外源ABA對側(cè)柏葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖2 ABA對H2O2脅迫下側(cè)柏葉片抗氧化酶活性和GSH的影響Fig. 2 Effects of ABA on superoxide (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities and GSH contents of P. orientalis under H2O2 stress

H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗外施不同濃度ABA的脯氨酸含量變化趨勢見圖3a。正常條件下外施不同濃度ABA處理6 h后，此時脯氨酸含量與對照CK之間差異不顯著；48 h后，低濃度0.5 μmol·L-1顯著提高了脯氨酸含量(P<0.05)。單一H2O2處理0～48 h，脯氨酸含量隨著時間延長而逐步增加；48 h時，H2O2脅迫與對照CK處理之間差異顯著，提高了24.66 %。H2O2+0.5ABA處理48 h提高脅迫葉片脯氨酸含量12.01 %，H2O2+200ABA處理則降低了10.95 %，兩者均與100 mmol·L-1H2O2脅迫處理間差異顯著(P<0.05)。

圖3b顯示，側(cè)柏葉片100 mmol·L-1H2O2處理6 h，脅迫葉片可溶性蛋白含量較對照CK差異不顯著(P>0.05)；處理48 h，可溶性蛋白含量較對照CK顯著降低了26.53 %；可溶性蛋白含量隨著脅迫時間(0～48 h)延長逐步下降，H2O2抑制了可溶性蛋白的合成，加速其水解，導(dǎo)致含量下降。正常條件外施0.5和200 μmol·L-1ABA 6 h均可顯著提高側(cè)柏葉片的可溶性蛋白含量，48 h后，200 μmol·L-1ABA處理的葉片可溶性蛋白含量有降低的趨勢，與對照CK差異不顯著(P>0.05)。0.5和200 μmol·L-1ABA處理6和48 h均能提高脅迫葉片可溶性蛋白含量，48 h后前者顯著性提高了69.48 %，后者與H2O2脅迫處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 ABA對H2O2脅迫下側(cè)柏葉片H2O2和MDA含量的影響Fig. 3 Effects of ABA on H2O2 and MDA contents of P. orientalis under H2O2 stress

2.4 外源ABA對側(cè)柏葉片活性氧代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖4顯示，正常和100 mmol·L-1H2O2脅迫下外施0.5和200 μmol·L-1的ABA致使側(cè)柏幼苗葉片活性氧代謝相關(guān)基因Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST表達(dá)水平產(chǎn)生變化。正常條件下0.5 μmol·L-1ABA處理的側(cè)柏葉片中Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST表達(dá)水平相較于200 μmol·L-1ABA處理有顯著性提高(P<0.05)，于6 h分別較對照CK顯著增加了2.87、0.98、1.15、1.00、0.98和2.96倍；處理48 h，分別提高3.82、1.98、3.84、2.03、3.68和5.94倍；側(cè)柏幼苗響應(yīng)100 mmol·L-1H2O2脅迫，于48 h其葉片活性氧代謝相關(guān)基因表達(dá)水平較對照CK均有顯著性提高，且在0～48 h內(nèi)，隨著脅迫時間延長，活性氧代謝相關(guān)基因表達(dá)水平逐步增加。此外，由圖4可知，相較于200 μmol·L-1ABA，0.5μmol·L-1ABA處理6和48 h更有利于提高H2O2脅迫條件下側(cè)柏葉片活性氧代謝相關(guān)基因Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST的表達(dá)量。其中6 h處理分別提高了0.79、1.34、0.98、0.07、0.30和-0.10倍；48 h處理提高了0.69、0.24、0.83、0.11、0.32和0.18倍，且隨著H2O2脅迫時間(0～48 h)延長，這六個活性氧代謝相關(guān)基因表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。

圖4 ABA對H2O2脅迫下側(cè)柏葉片Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effects of ABA on expression levels of Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR and GST of P. orientalis under H2O2 stress

3 討論

3.1 高、低濃度ABA對側(cè)柏葉片活性氧和膜脂過氧化的影響

許多植物已經(jīng)發(fā)展了復(fù)雜的脅迫響應(yīng)機(jī)制，改變它們的表型或生理特性來適應(yīng)環(huán)境變化，但持續(xù)不利的環(huán)境狀況均能誘使植物連續(xù)地產(chǎn)生ROS，使得ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡關(guān)系被打破，從而引起了植物的氧化脅迫。高鹽誘導(dǎo)氧化脅迫引起楊樹[26]和水稻[27]葉片中H2O2增加，膜脂過氧化程度加劇，致使MDA含量增加；鎘脅迫下姜葉片中H2O2和MDA增加[28]。外源ABA可以有效地提高活性氧酶促清除系統(tǒng)活性，降低ROS積累和細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)膜的完整性，從而緩解由氧化脅迫引起的植物損傷[7,8]。外施ABA能夠明顯提高高粱[29]和柑橘[30]的耐鹽性以及姜[13]的抗旱性等。然而，所需的ABA濃度因植物種類的不同有很大差異。在本實(shí)驗(yàn)中，H2O2脅迫處理6和48 h引起側(cè)柏幼苗葉片H2O2水平顯著增加，致使膜質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致MDA含量明顯升高；側(cè)柏葉片中H2O2和MDA含量隨著脅迫時間(0～48 h)的延長而逐步增加；相較于200 μmol·L-1ABA，H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗外施0.5 μmol·L-1ABA更有利于降低H2O2和MDA的積累(圖1)。

3.2 高、低濃度ABA對側(cè)柏葉片抗氧化酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

植物對短期氧化脅迫具有一定的適應(yīng)性，短時間脅迫可誘導(dǎo)其抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。如豌豆[31]和姜[13]的SOD、POD和CAT活性；水稻葉片Cu/ZnSOD、MnSOD、APX和CAT基因[32]、水稻OsAPX8[33]、穇子EcMDAR[34]、蘆葦PhaGRC[35]。鹽誘導(dǎo)氧化脅迫以及ABA處理均可引起白三葉草Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX和MDAR基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[36]。本研究中，側(cè)柏葉片中SOD和CAT活性經(jīng)H2O2脅迫處理48 h后顯著增加(圖2)，表明側(cè)柏幼苗對48 h短期脅迫具有一定的適應(yīng)性，可能和ROS水平上升誘導(dǎo)活性氧清除酶基因的表達(dá)水平有關(guān)[37]。而POD活性在6 h脅迫處理后相較于對照CK顯著降低，隨著脅迫時間延長至48 h，其活性緩慢上升，與對照CK處理間差異不顯著，；100 mmol·L-1H2O2處理48 h上調(diào)側(cè)柏幼苗葉片Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST基因的表達(dá)水平(圖4)。目前研究表明，ABA作為植物脅迫響應(yīng)中的重要信使，能夠通過提高ROS清除酶活性以及相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物的抗氧化脅迫能力[38-41]，還能通過增加GSH含量來增強(qiáng)植物的抗氧化脅迫能力[13]。如黃麻干旱脅迫45 d，葉片中的SOD和CAT活性被抑制，外施ABA能夠降低H2O2含量，提高植株活性氧清除酶SOD和CAT活性，緩解氧化脅迫[42]。編碼ROS清除酶基因的過量表達(dá)，如SOD[43]、CAT[44]、APX[45]、MDAR[46]、GR[47]和GPX[48]，能夠通過降低氧化損傷提高植物對不同非生物脅迫抗逆性。本研究中，正常和100 mmol·L-1H2O2側(cè)柏幼苗外施0.5 μmol·L-1ABA均能進(jìn)一步增加抗氧化酶SOD、POD和CAT活性(圖2)；相較于200 μmol·L-1ABA，外施0.5 μmol·L-1ABA更能誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)水平顯著提高。脅迫條件下，隨0.5 μmol·L-1ABA處理時間(0～48 h)的延長，Cu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDAR和GST基因的表達(dá)水平呈升高趨勢，較H2O2脅迫均有不同程度地上升(圖4)。

3.3 高、低濃度ABA對側(cè)柏葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

脯氨酸是在環(huán)境脅迫條件下積累在許多生物體中的一種重要的有機(jī)分子[49]。一些研究人員認(rèn)為脯氨酸積累可能與脅迫程度[50,51]或滲透調(diào)節(jié)[52]有關(guān)；相反地，也有一些專家則認(rèn)為這是脅迫損傷的癥狀而不是抗性指標(biāo)[53]。本研究中，H2O2脅迫誘導(dǎo)側(cè)柏葉片脯氨酸含量增加(圖3a)，處理48 h的脯氨酸含量高于6 h，隨著脅迫時間的延長而增加，可能與其細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[54]，這與燕麥脯氨酸的研究趨勢一致[55]。100 mmol·L-1H2O2脅迫下側(cè)柏幼苗外施0.5 μmol·L-1ABA處理48 h相較于200 μmol·L-1，脯氨酸水平顯著性提高(圖3a)，可能是因?yàn)榈蜐舛?.5 μmol·L-1ABA更利于促進(jìn)脯氨酸生物合成中相關(guān)酶的活性，延緩其降解，致使側(cè)柏葉片脯氨酸的積累從而增強(qiáng)植株的滲透調(diào)節(jié)能力。這一情況同樣出現(xiàn)在豆芽的研究中，即Khadri等[56]指出低濃度的ABA(1 μmol·L-1)增加了普通豆芽中的脯氨酸積累，提高了對氧化脅迫的耐受性。另外，在研究中，H2O2處理0～48 h，側(cè)柏葉片可溶性蛋白含量逐步下降；施加0.5 μmol·L-1ABA后明顯提高側(cè)柏葉片中可溶性蛋白含量，200 μmol·L-1ABA與脅迫處理差異不顯著(圖3b)，表明0.5 μmol·L-1ABA濃度更利于促進(jìn)H2O2脅迫下側(cè)柏蛋白合成。

4 結(jié)論

H2O2脅迫引起側(cè)柏葉片H2O2水平顯著增加，致使MDA含量明顯升高；而側(cè)柏葉片中SOD和CAT活性經(jīng)H2O2脅迫處理48 h后顯著增加，表明側(cè)柏幼苗對短期脅迫具有一定的適應(yīng)性，短期脅迫誘導(dǎo)抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。正常和H2O2脅迫條件下的側(cè)柏幼苗，相較于200 μmol·L-1ABA，外施低濃度0.5 μmol·L-1ABA均有利于維持葉片較高的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性和抗氧化物GSH含量，降低 H2O2和MDA積累，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力，同時更能誘導(dǎo)抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)水平顯著提高，表明外施ABA有利于提高抗氧化系統(tǒng)的防御能力，減弱幼苗的氧化脅迫和膜脂過氧化水平，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整，從而有效地緩解逆境脅迫對植物造成的氧化傷害。

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(責(zé)任編輯：張 研)

Reactive Oxygen Metabolism and Its Related Gene Expression inPlatycladusorientalisunder H2O2Stress and Regulated by ABA

YAOXia-mei1, 2,CHANGEr-mei1,JIJing1,YUEJian-yun1,XIETian-tian1,DENGNan1,SHISheng-qing1,JIANGZe-ping1

(1.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2 School of Biological Science and Food Engineering, Fuyang Normal University, Fuyang 236037, Anhui, China)

[Objective] To investigate the mechanism ofexogenousabscisicacid(ABA)on regulating oxidative stress of Platycladus orientalis，the effects of reactive oxygen metabolism were studied in the leaves ofP.orientalisexposed to hydrogen peroxide (H2O2) stress with the application of different concentrations of ABA. [Method]P.orientalisseedlings were exposed to 100 μmol·L-1H2O2were treated with 0.5 and 200 μmol·L-1ABA, and physiological indexes and expression levels of genes related to reactive oxygen metabolism were studied. [Result] (1) 100 mmol·L-1H2O2significantly increased the contents of H2O2, malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) and proline and activities of antioxidant enzymes SOD and CAT inP.orientalisleaves, while soluble protein content decreased at 48 h. (2) Compared with 200 μmol·L-1ABA, 0.5 μmol·L-1ABA significantly enhanced the activities of SOD, POD and CAT, and increased the contents of GSH, proline and soluble protein in H2O2-treated seedlings, accompanied by the reduction of H2O2and MDA contents. (3) 100 mmol·L-1H2O2up-regulated the expression levels ofCu/Zn-SOD、CAT、APX、MDAR和GSTgenes in P. orientalis at 48 h, and moreover, the presence of 0.5 μmol·L-1ABA further prompted the expression levels ofCu/Zn-SOD、CAT、GR、APX、MDARandGSTgenes, compared with 200 μmol·L-1ABA under normal and H2O2conditions. [Conclusion] Low concentration of 0.5 μmol·L-1ABA effectively enhanced antioxidant defense, reduced oxidative stress and membrane lipid peroxidation in leaves ofP.orientalisunder H2O2stress, which lowered the damage of reactive oxygen species toP.orientalisleaves and improved its resistance.

Platycladusorientalis; H2O2stress; ABA; reactive oxygen metabolism; gene expression

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.013

2016-07-14

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CAFYBB2014QB004)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300555)；安徽省哲學(xué)社會科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目(AHSKQ2016D110)；安徽省高校質(zhì)量工程項(xiàng)目(2014jyxm231)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201710371036、201710371037)

姚俠妹(1981—)，女，博士研究生，講師，主要從事樹木衰老方向研究。E-mail: yaoxiamei@126.com

* 通訊作者：江澤平，研究員，主要從事林木引種與植物地理、逆境生物學(xué)研究。E-mail: jiangzp@ caf.ac.cn

S718.43

A

1001-1498(2017)04-0624-09