杜新凱，任 娟，胡 珺，王常高，林建國，蔡 俊，杜 馨

(湖北工業(yè)大學 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068)

棉鈴蟲甾醇載體蛋白2原核表達及純化

杜新凱，任 娟，胡 珺，王常高，林建國，蔡 俊，杜 馨*

(湖北工業(yè)大學 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068)

甾醇載體蛋白2(SCP-2)在昆蟲體內(nèi)甾醇吸收及運輸過程中有著重要的生理功能。試驗構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-22b/HaSCP2，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)進行誘導表達，并對IPTG濃度、誘導時間及溫度進行優(yōu)化，經(jīng)Ni柱分離純化后分析其與膽固醇結(jié)合活性。SDS-PAGE分析表明，重組蛋白相對分子質(zhì)量約為16 ku，且在25 ℃，IPTG終濃度0.2 mmol·L-1下誘導10 h為最佳誘導表達條件。經(jīng)熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)競爭分析，膽固醇與HaSCP-2結(jié)合半數(shù)有效濃度(EC50)為29.03 μmol·L-1。該研究為深入研究棉鈴蟲SCP-2的功能以及后續(xù)HaSCP-2抑制劑的篩選研究奠定了基礎。

棉鈴蟲；甾醇載體蛋白2；原核表達；原核純化；原核優(yōu)化

甾醇載體蛋白(sterol carrier protein-2，SCP-2)又稱非特異性脂轉(zhuǎn)運蛋白(non-specific lipidtransfer proteins，nsLTPs)，是一類堿性可溶的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、細菌、真菌中[1]。已知的含SCP-2結(jié)構(gòu)域家族包括：SCP-2、SCP-x、類SCP-2(SCP-2-like)、17-β-羥基固醇脫氫酶Ⅳ (17-β-hydroxysteroid dehydrogenase-4)、短鏈脫氫酶(short-chain dehydrogenase) 和血紅細胞膜整合蛋白(stomatin)。SCP-2主要參與胞內(nèi)膽固醇、脂肪酸和脂肪酸輔酶A的吸收、轉(zhuǎn)運、氧化、酯化，以及磷脂代謝和信號傳遞等[2-3]。與哺乳動物不同，昆蟲自身不能合成類固醇，必須從食物中獲取谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和麥角甾醇等植物甾醇，再轉(zhuǎn)化為自身必須的膽固醇[4-5]。因此，昆蟲SCP-2在甾醇代謝過程中扮演重要的角色。

目前，已在果蠅(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)、家蠶(Bombyxmori)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、煙草天蛾(Manducasexta)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[6-12]等多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了SCP-x/2基因。SCP-2蛋白在體內(nèi)獨立表達，其大小約13～16 ku。SCP-2功能研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的埃及伊蚊、斜紋夜蛾細胞中超表達SCP-2，促進了膽固醇的吸收和積累。此外，埃及伊蚊、斜紋夜蛾、棉鈴蟲幼蟲RNA干擾與定點突變明顯降低膽固醇的水平[13-16]。目前，關于SCP-2在體內(nèi)膽固醇詳細的轉(zhuǎn)運機制仍不清楚。

棉鈴蟲是一類極具破壞性的世界農(nóng)業(yè)害蟲，對棉花，玉米，番茄和小麥等至少60種宿主植物造成危害[17]。據(jù)統(tǒng)計，棉鈴蟲已對多種殺蟲劑如擬除蟲菊酯類、煙堿類、阿維菌素、多殺菌素、有機磷、氨基甲酸酯以及Bt毒素等產(chǎn)生抗性[18]。近年來關于昆蟲SCP-2抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊SCP-2抑制劑(AeSCPIs)抑制蚊子和煙草天蛾幼蟲對膽固醇的吸收，同時具有明顯的致死效果[11，19-20]。此外，對棉鈴蟲的研究發(fā)現(xiàn)，AeSCPIs影響幼蟲發(fā)育，對低齡幼蟲具有致命性，同時推遲幼蟲化蛹和化蛾時間，降低卵孵化率[12]。昆蟲SCP-2作為新的害蟲防治的靶點，對新型殺蟲劑的開發(fā)具有重要意義。本文通過克隆棉鈴蟲SCP-2基因，進行構(gòu)建表達載體，原核表達及其蛋白活性分析為進一步HaSCP-2的生物學功能和后續(xù)HaSCP-2抑制劑的篩選研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗用昆蟲、菌株及質(zhì)粒

試驗用棉鈴蟲購自湖北生物農(nóng)藥工程研究中心，實驗室培養(yǎng)。大腸埃希菌E.coliBL21(DE3) 及質(zhì)粒載體pET-22b由本實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

質(zhì)粒DNA提取試劑盒，第一鏈cDNA合成試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ和XhoⅠ)、DNA Marker及PCR試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；Taq聚合酶、蛋白Marker購自Thermo scientific公司；氨芐青霉素(Amp)、IPTG購自Amresco公司；8-苯胺-1-萘磺酸(1， 8-ANS)購自阿拉丁生化科技有限公司；膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成、測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

VeritiTMPCR儀購自美國ABI公司；ZHWY恒溫搖床購自上海智誠分析儀器制造有限公司；JY92-11超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN蛋白質(zhì)電泳儀購自北京六一儀器廠；NGC蛋白層析儀購自美國BIO-RAD公司；Synergy2酶標儀購自美國BioTek公司；GBOX凝膠成像儀購自英國Syngene公司。

1.3HaSCP-2基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

棉鈴蟲中腸總RNA提取及第一鏈cDNA合成參照文獻[12]。根據(jù)HaSCP-x基因序列(GenBank JN582013)設計HaSCP-2擴增引物HaSCP-2F：ATCATATGATGTACCGCAAAGGATTC和HaSCP-2R：GTCTCGAGCCTATTTACAGTTTGGAACGA，添加NdeI和XhoI酶切位點。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：cDNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，HaSCP-2F 0.5 μL，HaSCP-2R 0.5 μL，Taq連接酶 0.5 μL，加無菌水至25 μL。反應條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸2 min。通過PCR擴增得到HaSCP-2基因序列，經(jīng)酶切后插入同樣酶切的pET-22b載體上。轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌E.coliBL21(DE3)中，在含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的LB平板上37 ℃過夜培養(yǎng)12 h。篩選陽性克隆單菌株，根據(jù)質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒并進行PCR擴增鑒定及測序鑒定。

1.4 HaSCP-2蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

取陽性單克隆菌株接種于含終濃度100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng)10 h。再以1%接種量接種到含新鮮氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至D600值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度0.3 mmol·L-1于30 ℃、220 r·min-1誘導表達10 h。培養(yǎng)菌液經(jīng)5 000 r·min-1離心5 min，PBS(pH 7.3)重懸后，加入Loading buffer，加熱煮沸5 min，通過15% SDS-PAGE電泳分析菌體重組蛋白表達情況。

1.4.1 誘導劑IPTG濃度的優(yōu)化

按上述方法活化含重組質(zhì)粒菌株，以1∶50比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，至D600值為0.6～0.8時分別加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol·L-1的IPTG，30 ℃、220 r·min-1誘導表達10 h。收集菌液，經(jīng)離心、PBS(pH 7.3)重懸后，通過12% SDS-PAGE電泳分析菌體重組蛋白表達情況。

1.4.2 誘導溫度的優(yōu)化

重組質(zhì)粒菌株培養(yǎng)同上，在最適IPTG濃度條件下，分別在20、25、30和37 ℃條件下220 r·min-1誘導10 h。收集菌液，經(jīng)離心、PBS(pH 7.3)重懸后，通過12% SDS-PAGE電泳分析菌體重組蛋白表達情況。

1.4.3 誘導時間的優(yōu)化

重組質(zhì)粒菌株培養(yǎng)同上，在最適IPTG濃度和最適溫度情況下，220 r·min-1分別誘導2、4、6、8、10和12 h。收集菌液，經(jīng)離心、PBS(pH 7.3)重懸后，通過15% SDS-PAGE電泳分析菌體重組蛋白表達情況。

1.5 HaSCP-2蛋白的純化

取陽性重組菌活化后，以1∶100比例擴大培養(yǎng)，按誘導表達優(yōu)化后條件進行誘導表達。收集菌液，5 000 r·min-1離心5 min，PBS(pH 7.3)重懸后，再離心并用平衡緩沖液(25 mmol·L-1咪唑，20 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重懸，于冰浴中超聲破碎裂解，功率180 W，超聲6 s，間隔4 s。10 000 r·min-1，4 ℃，離心15 min，取上清液。將上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后于鎳離子層析柱進行親和純化，用洗脫緩沖液(300 mmol·L-1咪唑，20 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)梯度洗脫目的蛋白。純化后的蛋白在冰水浴下透析約10 h，再經(jīng)超濾管濃縮。通過15%的SDS-PAGE電泳分析HaSCP-2重組蛋白的純度，采用Bradford法[21]測定純化的蛋白濃度。

1.6 HaSCP-2蛋白與膽固醇結(jié)合活性

使用8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)熒光探針檢測其與HaSCP-2蛋白結(jié)合能力。在200 μL反應體系中，加入純化后的重組HaSCP-2蛋白終濃度為30 mmol· L-1，不同終濃度的1，8-ANS分別為0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50和55 μmol·L-1。孵育3 min后，酶標儀檢測，激發(fā)光360 nm，發(fā)射光460 nm，狹縫均為20 nm。記錄HaSCP-2蛋白和不同濃度1，8-ANS反應后的熒光值，分析結(jié)合能力，計算公式：Y=Bmax×X/(Kd+X)。

膽固醇與HaSCP-2蛋白結(jié)合親和力通過競爭取代分析測定。在96孔熒光酶標板中，10 μmol·L-1重組HaSCP-2蛋白與20 μmol·L-11，8-ANS混合反應2 min，在加入不同濃度膽固醇溶液(終濃度5、10、20、50和100 μmol·L-1)，反應3 min后記錄熒光值。通過單位點競爭結(jié)合，非線性回歸分析計算半數(shù)效應濃度(EC50)，計算公式為：Y=Best fit value MIN + (Best fit value MAX-Best fit value MIN)/(1+10(X-lgEC50)) 。

2 結(jié)果與分析

2.1HaSCP-2基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

從棉鈴蟲中腸總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA序列，以HaSCP-2F和HaSCP-2R為引物擴增得到HaSCP-2基因序列，經(jīng)NdeI和XhoI酶切插入同樣酶切的pET-22b載體上，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆菌提取重組質(zhì)粒，PCR鑒定(圖1)和基因測序驗證，測序結(jié)果與NCBI上HaSCP-2序列一致，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

M， DL2000 DNA Marker；1， pET-22b/HaSCP2重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker；1，pET-22b/HaSCP2 plasmids PCR product圖1 重組pET-22b/HaSCP2質(zhì)粒PCR鑒定Fig.1 Identification of pET-22b/HaSCP-2 plasmids PCR amplification

2.2 HaSCP-2蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

取含重組質(zhì)粒pET-22b/HaSCP-2的BL21(DE3)菌株進行培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，在16 ku左右出現(xiàn)一條蛋白帶，與目標蛋白分子量相符；未誘導重組菌則無該蛋白表達。由此可見，該蛋白條帶為重組HaSCP-2蛋白。

通過對誘導劑IPTG濃度，誘導溫度和誘導時間進行優(yōu)化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在30 ℃、不同IPTG濃度下誘導10 h，目標蛋白的表達量并沒有太大變化(圖2)。高濃度的IPTG沒有明顯增加蛋白含量，考慮到高濃度IPTG對細胞的抑制影響，選擇最佳IPTG濃度為0.2 mmol·L-1；分別在20、25、30和37 ℃，終濃度0.2 mmol·L-1IPTG下誘導10 h(圖3)，蛋白表達量在25 ℃時最大，隨著溫度的升高，蛋白表達量明顯下降，因此選擇最佳誘導溫度25 ℃；在25 ℃，終濃度0.2 mmol·L-1IPTG下分別誘導2、4、6、8、10和12 h(圖4)，在0～10 h蛋白表達量隨著時間的增加而增加，10 h后表達量穩(wěn)定，因此選擇最佳誘導時間為10 h。

M， 蛋白質(zhì)分子量標準；1～2， 未誘導組；3～8， 不同濃度IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol·L-1)處理組M， Marker; 1-2， Non-induced group; 3-8， Treatments of different concentrations of IPTG (0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2 mmol·L-1)圖2 誘導劑IPTG對重組HaSCP-2蛋白表達的影響Fig.2 Effects of IPTG concentrations on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

2.3 HaSCP-2蛋白的純化

在最佳誘導條件下對重組菌大量誘導表達，經(jīng)親和鎳柱結(jié)合后，在150 mmol·L-1咪唑濃度下開始洗脫蛋白，再透析脫鹽。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，在16 ku處得到較純的重組HaSCP-2蛋白，含量在90%以上。純化的蛋白經(jīng)Bradford法測得的濃度為1.003 mg·mL-1(圖5)。

M， 蛋白質(zhì)分子量標準；1～4， 不同誘導溫度(20、25、30和37 ℃)實驗組；5， 未誘導組M， Marker; 1-4， Treatments of different temperature (20， 25， 30， 37 ℃); 5， Non-induced group圖3 誘導溫度對重組HaSCP-2蛋白表達的影響Fig.3 Effects of induced temperature on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

M， 蛋白質(zhì)分子量標準；1， 未誘導組；2～6， 實驗組不同誘導時間依次為2、4、6、8、10和12 hM， Marker; 1， Non-induced group; 2-6， Treatments of different induced time (2， 4， 6， 8， 10， 12 h)圖4 誘導時間對重組HaSCP-2蛋白表達的影響Fig.4 Effects of induced time on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

2.4 HaSCP-2蛋白與膽固醇結(jié)合活性

熒光探針1，8-ANS與HaSCP-2蛋白結(jié)合曲線如圖6所示，隨著1，8-ANS濃度的升高，熒光強度逐漸升高，在50 μmol·L-1濃度后熒光值趨于飽和，表明蛋白和1，8-ANS有效結(jié)合。通過單位點結(jié)合、非線性回歸分析得到HaSCP-2蛋白與1，8-ANS的結(jié)合常數(shù)為1.973 μmol·L-1(R2= 0.98)。

HaSCP-2蛋白與1，8-ANS結(jié)合后，通過不同濃度膽固醇競爭取代1，8-ANS。如圖7，隨著膽固醇濃度的升高，體系相對熒光強度(relative fluorescence units，RFU)降低，表明熒光探針1，8-ANS被膽固醇從蛋白結(jié)合位點競爭取代，通過計算得到膽固醇結(jié)合半數(shù)有效劑量EC50值為29.03 μmol·L-1。

M， 蛋白質(zhì)分子量標準；1， 未誘導菌液；2， 誘導后菌液；3， 經(jīng)鎳柱純化重組HaSCP-2蛋白；4， 透析后重組HaSCP-2蛋白M， Marker; 1， Non-induced bacteria liquid; 2， Induced bacteria liquid; 3， Recombinant HaSCP-2 protein purified through Ni2+-affinity column; 4， Recombinant HaSCP-2 protein after dialysis圖5 重組HaSCP-2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant HaSCP-2 protein

圖6 HaSCP-2蛋白與1，8-ANS結(jié)合曲線Fig.6 Binding curve of HaSCP-2 protein and 1，8-ANS

圖7 1，8-ANS與膽固醇競爭結(jié)合HaSCP-2分析Fig.7 Competitive binding assay of 1，8-ANS in HaSCP-2 with cholesterol

3 討論

昆蟲SCP-2蛋白在中腸細胞中表達量最高，能更好的吸收膽固醇，對昆蟲正常生長、發(fā)育和繁殖起著重要的作用[11-12，22]。本研究從棉鈴蟲中腸提取RNA，克隆HaSCP-2基因，選用大腸埃希菌做為克隆和表達。大腸埃希菌易繁殖培養(yǎng)，已被廣泛應用于表達宿主菌。pET-22b系統(tǒng)所帶His標簽小，不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，且蛋白表達量大，易純化，故以此進行克隆表達。PCR條帶單一，且序列一致，說明該載體可用于重組HaSCP-2表達。重組蛋白原核表達受誘導劑、誘導溫度和時間的影響，對誘導條件優(yōu)化可提高重組蛋白的產(chǎn)量。在不同IPTG濃度下，重組蛋白產(chǎn)量并沒有顯著變化，高濃度的IPTG可能抑制重組蛋白的表達，因此低濃度的IPTG濃度更適合用于誘導表達。隨著溫度的升高，蛋白產(chǎn)量反而下降，這表明30～37 ℃下菌體更容易生長。在最適IPTG濃度和誘導溫度下，蛋白量不斷積累，10 h后蛋白量變化不大。因此，重組蛋白最佳誘導表達條件為25 ℃，IPTG終濃度0.2 mmol·L-1下誘導10 h。

SCP-2與配體結(jié)合親和力通過競爭取代分析，常用的熒光探針有NBD放射標記膽固醇(NBD-cholesterol)[14]和8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)[15]。1，8-ANS相比NBD膽固醇更加廉價，且適合大規(guī)模藥物篩選。1，8-ANS在水溶液中幾乎無熒光，但是與蛋白疏水性表面結(jié)合后發(fā)出熒光，因此可用來作為探針用于競爭取代分析。重組HaSCP-2與1，8-ANS結(jié)合后發(fā)出熒光，可判斷1，8-ANS結(jié)合到蛋白疏水腔中，天然底物膽固醇競爭取代1，8-ANS后熒光強度下降，表明蛋白具有生物學活性，且半數(shù)有效劑量EC50值為29.03 μmol·L-1。綜上所述，本試驗可為后續(xù)HaSCP-2抑制劑的研發(fā)及SCP-2特異性新型農(nóng)藥的研發(fā)奠定基礎。

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(責任編輯 張 韻)

Prokaryotic expression and purification of sterol carrier protein-2 fromHelicoverpaarmigera

DU Xinkai， REN Juan， HU Jun， WANG Changgao， LIN Jianguo， CAI Jun， DU Xin*

(KeyLaboratoryofFermentationEngineering(MinistryofEducation)，HubeiProvincialCooperativeInnovationCenterofIndustrialFermentation，HubeiKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430068，China)

Sterol carrier protein 2 (SCP-2) plays important physiological roles in sterols absorption and transport in insects. In this study， the recombinant expression plasmid pET-22b/HaSCP2 was constructed and transformed intoE.coliBL21 (DE3) for inducible expression. Induction conditions of the IPTG concentrations， the induction time and temperature were optimized. The recombinant HaSCP-2 was purified using Ni2+-affinity column， and the protein functions of HaSCP-2 was tested by competitive displacement assay. SDS-PAGE analysis suggested that the molecular weight of the recombinant protein was about 16 ku， and the optimal expression conditions were at the temperature of 25 ℃ and at the final concentration of 0.2 mmol·L-1IPTG for 10 h. Fluorescent probe 8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid (1，8-ANS) was used for competitive analysis， and 1，8-ANS was replaced by cholesterol bound to HaSCP-2 with a half effective concentration (EC50) of 29.03 μmol·L-1. This study provides good opportunity for further study on the function of HaSCP-2 and the screening of HaSCP-2 specific inhibitors.

Helicoverpaarmigera; sterol carrier protein-2; prokaryotic expression; prokaryotic purification; prokaryotic optimization

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.15

2017-02-22

國家自然科學基金項目(31401807)；湖北工業(yè)大學高層次人才科研啟動項目(BSQD13002)；湖北工業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201510500064)

杜新凱(1991—)，男，河南靈寶人，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵過程優(yōu)化。E-mail: duxinkai78@163.com

*通信作者，杜馨，E-mail: 99023801@qq.com

S435

A

1004-1524(2017)07-1166-06

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1166-1171

杜新凱，任娟，胡珺，等. 棉鈴蟲甾醇載體蛋白2原核表達及純化[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(7)： 1166-1171.