（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

SPME-GC-MS法分析不同菌種比例混合發(fā)酵對(duì)酸乳風(fēng)味的影響

靳汝霖，武士美，任為一，丹彤，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

∶探討了不同比例德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的影響。以三種不同比例（1∶10，1∶100，1∶1000）的德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的混合發(fā)酵乳為研究對(duì)象，采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS），并結(jié)合內(nèi)標(biāo)法對(duì)各復(fù)配發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明，三種比例的復(fù)配組發(fā)酵乳中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是由酸類、醇類、酮類、醛類以及酯類等化合物組成，且各復(fù)配組發(fā)酵乳在貯藏期間主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和數(shù)量存在明顯差異，其中1∶100復(fù)配組的發(fā)酵乳中主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他復(fù)配組，是理想的組合。

∶發(fā)酵乳；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；固相微萃?。⊿PME）；氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

0 引言

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）協(xié)同發(fā)酵牛乳，可產(chǎn)生少量副產(chǎn)物，并形成發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)[1-2]，其中，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成具有決定性作用[3]。已報(bào)道的有關(guān)發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究中，只將少數(shù)含量很高的幾種化合物作為主要的風(fēng)味物質(zhì)，如Gallardo-Escamilla等[4]在分析發(fā)酵乳清液的風(fēng)味時(shí)，發(fā)現(xiàn)其主要特征風(fēng)味物質(zhì)有乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸等；王偉君等[5]在嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中共鑒定出13種相關(guān)風(fēng)味成分，其中主要風(fēng)味物質(zhì)有2，3-丁二酮、2，3-戊二酮等。本研究將德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040分別以1∶10、1∶100和1∶1000的比例進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS），并結(jié)合內(nèi)標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。通過(guò)分析三個(gè)復(fù)配組發(fā)酵乳風(fēng)味的構(gòu)成及特點(diǎn)，旨在改善發(fā)酵乳的風(fēng)味品質(zhì)，為乳酸菌發(fā)酵劑的篩選及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用的發(fā)酵菌株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）IMAU40040（Genbank號(hào)∶FJ749316）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bul?garicus）IMAU20240（Genbank號(hào)∶HM057974）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 材料與培養(yǎng)基

全脂乳粉，MRS液體培養(yǎng)基，M17液體培養(yǎng)基，C3～C20正構(gòu)烷烴（色譜純），1，2-二氯苯（標(biāo)準(zhǔn)品）。

1.3 儀器設(shè)備

雷磁pH計(jì)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B GC system-5977A MSD），色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣手柄，萃取頭（65 μm PDMS/DVB）。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化和菌懸液的制備

將菌種保藏管中的嗜熱鏈球菌IMAU40040和德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240分別在脫脂乳培養(yǎng)基（10%脫脂乳，0.1%酵母粉）中活化，再分別轉(zhuǎn)接于M17和MRS液體培養(yǎng)基活化三代，使菌株活力達(dá)到最大。將菌株分別于50，100 mL和200 mL的MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用滅菌的PBS緩沖液洗滌去除培養(yǎng)基成分，置于PBS保護(hù)液，制得菌懸液于4℃保存，12 h內(nèi)使用。

1.4.2 發(fā)酵乳制備

將蒸餾水預(yù)熱至50℃加入11.5%的全脂乳粉混勻，待溫度上升至60℃，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%蔗糖，水和30 min后均質(zhì)（低壓15 MPa，高壓35 MPa），接著90～95℃殺菌5～10 min，待冷卻至42℃，接種并分裝于樣品瓶恒溫發(fā)酵至pH值小于4.5且酸度大于70°T（發(fā)酵終點(diǎn)），轉(zhuǎn)移至4℃貯藏12 h。

接種∶將5×106g-1的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌按1∶10，1∶100，1∶1000的比例接入滅菌后的全脂乳（非脂乳固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.87%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.08%）中。發(fā)酵完畢的發(fā)酵乳于4℃貯藏12 h后取樣，-20℃保藏。

1.4.3 樣品前處理

樣品中加入0.05 mL 1，2-二氯苯（最終質(zhì)量濃度約為0.01 ppm）作為內(nèi)標(biāo)物，然后將老化后的萃取頭通過(guò)密封墊插入樣品瓶，頂空吸附60 min。每個(gè)比例樣品各取3個(gè)平行。

1.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

色譜條件∶起始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min升溫速率升至140℃，保持1 min，以10℃/min升溫到250℃，保持3 min；汽化室溫度為250℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件∶EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍（m/z）33～450 AMU；發(fā)射電流100 μA。

萃取條件∶平衡溫度為50℃，平衡時(shí)間為60 min。

解吸附條件∶250℃條件下解吸附3 min。

1.4.5 定性與定量分析

利用隨機(jī)攜帶Masshunter工作站NIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，采用以上相同的程序升溫條件，用C3～C20正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算樣品中檢測(cè)的化合物的保留指數(shù)（reten?tion index，RI），同時(shí)結(jié)合相似度并參考相關(guān)文獻(xiàn)色譜保留指數(shù)[6-9]共同定性，確定出相應(yīng)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類。采用各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積對(duì)比進(jìn)行半定量分析，計(jì)算公式為

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用SPME-GC-MS法分析不同比例（1∶10、1∶100和1∶1000）保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的復(fù)配發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，在貯藏12 h時(shí)的分離情況見圖1，測(cè)定結(jié)果如表1～表5所示。

圖1 貯藏12 h時(shí)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的總離子圖

2.1 酸類化合物的比較分析

酸類化合物一般是通過(guò)脂肪分解和微生物發(fā)酵產(chǎn)生的[3]。由表1可知，貯藏12 h時(shí)三種比例復(fù)配組的發(fā)酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量出現(xiàn)顯著差異。3種比例復(fù)配組的發(fā)酵乳中檢出的共有的酸類化合物有4種，分別為戊酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸，且各復(fù)配組中各組分含量有明顯差異，其中，1∶100復(fù)配組中各組分含量高于其他復(fù)配組，分別為4.57，174.37，18.39，12.95（×10-6）。除上述共有化合物外，各復(fù)配組發(fā)酵乳中還檢出一些獨(dú)有成分，如1∶10復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出丙基丙二酸、2-甲基己酸，1∶100復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出丁酸、n-癸酸，1∶1000復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出2-甲基丙酸。通過(guò)分析3組復(fù)配組發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)1∶100復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量明顯高于其他復(fù)配組，如乙酸、己酸的含量分別為20.24、18.39 ppm，遠(yuǎn)高壬酮，且含量較低。一些研究者認(rèn)為2，3-丁二酮是發(fā)酵乳風(fēng)味形成的關(guān)鍵成分[15]，可以賦予發(fā)酵乳濃郁的奶油香味[16]。本實(shí)驗(yàn)在貯藏12 h時(shí)三個(gè)復(fù)配組均未檢出2，3-丁二酮，這可能由于2，3-丁二酮在3-羥基-2-丁酮還原酶的作用下發(fā)生不可逆反應(yīng)代謝為3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）。乙偶姻是許多乳制品中常見的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予發(fā)酵乳弱奶油香味[3]。由表2可以看出，在貯藏12 h時(shí)三個(gè)復(fù)配組發(fā)酵乳中均檢出于其他比例的復(fù)配組。乙酸、己酸等揮發(fā)性酸能增加發(fā)酵乳的酸味[10]，在其他研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[11]。綜上所述，當(dāng)保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的添加比例為1∶100時(shí)，發(fā)酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量顯著優(yōu)于其他比例的復(fù)配組。

表1 貯藏期間酸類化合物的鑒定結(jié)果

2.2 酮類化合物的比較分析

酮類化合物主要是由不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸降解或微生物代謝所產(chǎn)生[12-13]。本實(shí)驗(yàn)在貯藏12 h時(shí)三個(gè)復(fù)配組共檢出7種酮類物質(zhì)，包括3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、5-甲基-3-庚酮及2-十一酮。這些化合物均在復(fù)配組1∶10和1∶100中被檢出，而在復(fù)配組1∶1000的發(fā)酵乳中只檢測(cè)出3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-乙偶姻，且1∶100復(fù)配組中其含量為74.33×10-6，明顯高于其他復(fù)配組。此外，由辛酸的β氧化和癸酸的脫羧反應(yīng)得到的2-庚酮、2-壬酮兩個(gè)甲基酮[17]均在復(fù)配組1∶10和1∶100中檢出，而在復(fù)配組1∶1000的發(fā)酵乳中只檢出2-壬酮，這些化合物可賦予發(fā)酵乳水果味、奶香味，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的構(gòu)成具有重要意義[4]。針對(duì)不同比例復(fù)配組發(fā)酵乳風(fēng)味差異性的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)配組1∶100發(fā)酵乳中的酮類化合物的種類和含量顯著高于其他比例的復(fù)配組。

2.3 醇類化合物的比較分析

醇類化合物一般是由脂肪酸衍生而來(lái)或羰基化合物還原而來(lái)[18-19]。由表3可知，貯藏12 h時(shí)從三個(gè)比例的復(fù)配組發(fā)酵乳中共檢出12種醇類化合物，且各復(fù)配組中醇類化合物的種類和含量明顯不同。其中，復(fù)配組1∶10、1∶100、1∶1000發(fā)酵乳中分別檢出10、8、3種醇類化合物。在上述不同比例復(fù)配發(fā)酵乳中檢出

的共有醇類化合物有3-甲基-1-丁醇、1-庚醇和1-辛醇，且各復(fù)配組中的含量出現(xiàn)明顯差異。其中，復(fù)配組1∶100發(fā)酵乳中共有醇類化合物的含量遠(yuǎn)高于其他復(fù)配組，分別為13.49，17.17，14.43（×10-6）。除上述共有醇類化合物外，各復(fù)配組發(fā)酵乳中還檢出一些獨(dú)有成分，如1∶10復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出4-甲基環(huán)己醇、反-1，2-環(huán)戊二醇、反式-2-辛烯-1-醇、2，7-二甲基正辛醇，1∶100復(fù)配組發(fā)酵乳中檢出3-甲基甲酸丁醇，1-己醇，而在1∶1000復(fù)配組發(fā)酵乳中沒(méi)有檢出獨(dú)有化合物。大多醇類化合物的風(fēng)味閾值較高，因此認(rèn)為這類化合物對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味影響貢獻(xiàn)不大[20]。

表2 貯藏期間酮類化合物的鑒定結(jié)果

表3 貯藏期間醇類化合物的鑒定結(jié)果

2.4 醛類化合物的比較分析

醛類化合物的閾值較低，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大[21]。本實(shí)驗(yàn)中檢出7種醛類化合物，其中1∶1000復(fù)配組發(fā)酵乳中僅檢出3-甲基丁醛和3-羥基丁醛，而這兩種物質(zhì)在復(fù)配組1∶100和1∶10發(fā)酵乳中均有檢出，且復(fù)配組1∶100發(fā)酵乳中含量相對(duì)較高。此外，復(fù)配組1∶10和1∶100的發(fā)酵乳中還檢出其他多種醛類化合物，包括乙醛、庚醛、反-2-辛烯醛、己醛及2-甲基丙醛等。其中，乙醛是發(fā)酵乳中重要的風(fēng)味化合物[22]，純乙醛具有辛辣刺激性的氣味，但適量濃度的乙醛不僅能平衡發(fā)酵乳風(fēng)味而且能賦予產(chǎn)品良好的風(fēng)味[23]。一般認(rèn)為具有典型風(fēng)味發(fā)酵乳中乙醛含量為10～15×10-6，而高品質(zhì)發(fā)酵乳中的乙醛含量要高于31.27×10-6。由表4中可以看出，貯藏12 h時(shí)，復(fù)配組1∶10、1∶100發(fā)酵乳中檢出的乙醛含量分別為6.83和34.56×10-6ppm，而在1∶1000復(fù)配發(fā)酵乳中沒(méi)有檢測(cè)到乙醛，說(shuō)明復(fù)配組1∶100發(fā)酵乳的風(fēng)味要優(yōu)于其他復(fù)配組。除乙醛外，其他醛類化合物的存在也對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味產(chǎn)生影響，如己醛作為亞油酸的主要氧化產(chǎn)物[24]，可對(duì)發(fā)酵乳整體風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[25]。

2.5 酯類化合物的比較分析

發(fā)酵乳中的酯類物質(zhì)大多是分子量較小的酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)或環(huán)化反應(yīng)生成的低級(jí)脂肪酸化酯及內(nèi)酯[26]。大多數(shù)的酯類化合物的閾值較低，具有果香味或堅(jiān)果仁味，可以降低脂肪酸和胺類物質(zhì)帶來(lái)的苦澀味[27]。本實(shí)驗(yàn)在貯藏12 h時(shí)共檢出4種酯類物質(zhì)，包括甲酸乙烯酯、硝酸正戊酯、乙酰乙酸壬酯及2-乙基丁酸烯丙酯，其中甲酸乙烯酯在三個(gè)復(fù)配組（1∶10、1∶100、1∶1000）發(fā)酵乳中均有檢出，其含量分別為7.90、39.14和28.14×10-6。其余酯類化合物只在復(fù)配組1∶10發(fā)酵乳中被檢出，且含量較低，對(duì)發(fā)酵乳的整體風(fēng)味影響較低。

表4 貯藏期間醛類化合物的鑒定結(jié)果

表5 貯藏期間酯類化合物的鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040以不同比例（1∶10，1∶100和1∶1000）復(fù)配，采用1，2-二氯苯作為內(nèi)標(biāo)，利用固相微萃取前處理方法，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，各比例復(fù)配組發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物主要由酸類、醇類、酮類、醛類以及酯類等化合物組成；且三個(gè)復(fù)配組發(fā)酵乳在貯藏期間主要的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量存在明顯差異，其中，復(fù)配組1∶100的發(fā)酵乳中主要的揮發(fā)性風(fēng)味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他復(fù)配組發(fā)酵乳，說(shuō)明保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040活菌數(shù)的比例為1∶100時(shí)，其發(fā)酵乳的風(fēng)味優(yōu)于其他組合。

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Analysis of fermented milk flavor in mixed fermentation of different strains with various proportions by SPME-GC-MS

JIN Rulin，WU Shimei，REN Weiyi，DAN Tong，SUN Tiansong
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural Universi?ty，Hohhot 010018，China）

∶The effects ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusandStreptococcus thermophiluswith different proportions on the fer?mented milk flavor were studied.The volatile flavor compounds of fermented milkby starters ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus IMAU20240 andStreptococcus thermophilusIMAU40040 in three different ratios（1∶10，1∶100 and 1∶1000）were detected using solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-GC-MS）technique，and internal standard method.The results showed that the main volatile flavor compounds in all of fermented milk groups were composed by acids，alcohols，ketones，aldehydes and es?ters.But the types and quantities of main flavor compounds were significantly different during storage.Among them，the fermented milk group in a ratio of 1∶100 had acetic acid，acetoin，acetaldehyde，hexyl alcohol，vinyl formate and 3-methyl-1-butanol and their content were higher than the other groups，so two strains in the ratios 1∶100 was considered as the ideal combination.

∶fermented milk；volatile flavor compounds；solid phase microextraction（SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

Q93-33

：A

：1001-2230（2017）06-0009-06

2016-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471711；31460446）。

靳汝霖（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)與工程。

孫天松