葉永順， 劉 華

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)二科， 廣東 廣州 510080)

長春西汀注射液減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷*

葉永順， 劉 華△

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)二科， 廣東 廣州 510080)

目的： 觀察長春西汀注射液對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的作用，并研究初步的作用機(jī)制。方法：雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組(control)、模型組(ALI組)以及長春西汀低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。正常對照組股靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(5 mL/kg)；模型組股靜脈注射LPS 10 mg/kg；長春西汀低、中和高劑量組股靜脈注射LPS 10 mg/kg，30 min后分別腹腔注射長春西汀注射液0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和1.2 mg/kg。伊紅染色觀察肺部組織病理學(xué)切片，TUNEL法檢測肺組織的細(xì)胞凋亡，分光光度法檢測并計(jì)算肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性，Western blot法檢測肺組織中NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、Bax與Bcl-2的蛋白水平。結(jié)果：與模型組相比，采用長春西汀給藥后，明顯減輕急性肺損傷的肺組織結(jié)構(gòu)損傷與炎性細(xì)胞浸潤，降低肺組織凋亡的細(xì)胞數(shù)與MPO活性，下調(diào)細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、VCAM-1與Bax的蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：長春西汀注射液對急性肺損傷大鼠的肺組織具有保護(hù)作用，可能與降低肺組織中MPO活性，以及調(diào)控NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

長春西汀注射液； 脂多糖; 急性肺損傷

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期階段，是由直接或間接原因?qū)е碌姆闻萆掀ぜ?xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[1]。臨床上主要表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸窘迫和低氧血癥，死亡率高達(dá)30%～40%[2]。目前主要的治療策略包括遏制全身炎癥反應(yīng)，呼吸支持治療與糖皮質(zhì)激素等，但未能有效地降低死亡率。因此，需要進(jìn)一步研究能有效降低急性肺損傷死亡率的治療方法與有效藥物。

長春西汀(vinpocetine，Vin)，也稱為阿樸長春胺酸乙酯，由Gedeon Richter研發(fā)，目前主要的臨床應(yīng)用是治療缺血性中風(fēng)和其它由腦血管病變引起的疾病[3]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，長春西汀具有抗炎作用，能抑制血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor-κB， NF-κB)活化，進(jìn)一步抑制炎癥因子的活化等[4]。由此，我們通過用注射脂多糖建立急性肺損傷大鼠模型，觀察長春西汀注射液對急性肺損傷大鼠的肺組織保護(hù)作用，并探討其初步機(jī)制。

材 料 和 方 法

健康雄性Wistar大鼠50只，SPF級，體重180～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SCXK 粵2014-0012，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食，不禁水。

長春西汀注射液購自河南潤弘制藥股份有限公司；TUNEL試劑盒購自Sigma-Aldrich；抗NF-κB、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)抗體購自Santa Cruz；抗Bax與Bcl-2抗體購自碧云天技術(shù)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物的分組與建模 將大鼠隨機(jī)分為5組(每組10只)：正常對照(control)組、模型組(ALI組)以及長春西汀低劑量組(Vin-L組)、中劑量組(Vin-M組)和高劑量組(Vin-H組)。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，正常對照組股靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(5 mL/kg)；模型組股靜脈注射LPS 10 mg/kg；長春西汀低、中和高劑量組股靜脈注射LPS 10 mg/kg，30 min后分別腹腔注射長春西汀注射液0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和1.2 mg/kg。若實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快，皮膚發(fā)紺，提示脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型建立成功[5]。

2.2 標(biāo)本采集 給藥6 h后，經(jīng)頸部正中切開皮膚，暴露右頸總動脈，頸動脈放血處死，開胸，取出左肺立刻置于液氮中低溫保存，取出右肺中葉用10%多聚甲醛固定，備用。

2.3 病理學(xué)檢查 將右肺中葉固定后，用石蠟包埋后切片，厚度約4 μm，分別加入二甲苯I、II，再依次浸入梯度乙醇，蒸餾水浸洗5 min×2次，甩干水分，用蘇木精染色15 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗，1%伊紅溶液染色3 min，梯度乙醇浸洗，二甲苯I、II液各5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將右肺中葉依次放入二甲苯I、II液各15 min，依次放入梯度乙醇各5 min，水化，PBS浸泡3 min，加入蛋白酶K處理30 min，洗滌，浸泡于3%雙氧水甲醇溶液，PBS洗滌，滴加TUNEL染色液1與2混合液反應(yīng)30 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的檢測 凍存的肺組織100 mg，加入4 mL磷酸鉀緩沖液，冰浴中勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，沉淀加入4 mL含0.5% HTAB的磷酸鉀緩沖液，重懸，超聲，60 ℃水浴1 h，4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取0.1 mL上清液，加入含鹽酸鄰聯(lián)茴香胺與過氧化氫的磷酸鉀緩沖液2.9 mL，25 ℃、460 nm波長下分光光度計(jì)測吸光度變化值，計(jì)算MPO活性。

采用馬鈴薯培養(yǎng)基[19]，分別接種10-5、 10-6、10-7、10-8四個(gè)稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養(yǎng)皿于25 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)選取培養(yǎng)基上菌絲細(xì)長，菌落疏松呈絨毛狀面絮狀的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.6 Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 取凍存的肺組織，用干凈剪刀剪碎，玻璃勻漿器冰上勻漿，加入裂解液裂解30 min，將裂解液移至離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入封閉液中室溫孵育1 h，加入 I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌2次，加入相應(yīng) II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，化學(xué)發(fā)光法顯色，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織病理學(xué)檢查

正常對照組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組和長春西汀低、中、高劑量組大鼠的肺組織均出現(xiàn)明顯的損傷；模型組大鼠的肺組織損傷明顯，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)不完整；采用長春西汀給藥后，肺泡結(jié)構(gòu)略顯完整，并隨藥物濃度升高，炎性細(xì)胞浸潤逐漸減少，見圖1。

Figure 1.The effect of vinpocetine on the pathological changes of the lung tissues from the rats with ALI (HE staining， ×200).

圖1 長春西汀對急性肺損傷肺組織的病理學(xué)影響

2 肺組織中細(xì)胞的凋亡檢測

與正常對照組相比，在脂多糖的刺激下，模型組大鼠肺組織可見明顯的凋亡細(xì)胞；與模型組相比，長春西汀給藥組的肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)隨藥物濃度升高而逐漸下降，見圖2。

Figure 2.The effect of vinpocetine on the cell apoptosis in the lung tissues (TUNEL staining， ×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖2 長春西汀對肺組織細(xì)胞凋亡的影響

3 肺組織中MPO活性的檢測

與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中MPO活性明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，長春西汀低、中與高劑量組的肺組織中MPO活性明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effect of vinpocetine on the MPO activity in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖3 長春西汀對肺組織中MPO活性的影響

4 肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的變化

與正常對照組相比，模型組的NF-κB、ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，與模型組相比，采用長春西汀給藥后，肺組織中NF-κB、ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)明顯下降，隨藥物濃度上升而下降幅度增大，見圖4。

Figure 4.The effect of vinpocetine on the protein expression of NF-κB, ICAM-1 and VCAM-1 in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖4 長春西汀對肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

5 Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

與正常對照組相比，模型組的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，采用長春西汀給藥后，Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯升高，Bax的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，高劑量組的變化幅度最大(P<0.05),見圖5。

Figure 5.The effect of vinpocetine on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖5 長春西汀對肺組織中Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

討 論

肺組織炎癥和肺水腫是急性肺損傷的主要病理特征，病理學(xué)主要顯示為肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示長春西汀能夠改善急性肺損傷的肺泡結(jié)構(gòu)損傷，并降低炎性細(xì)胞的浸潤。中性粒細(xì)胞被激活后，釋放活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等有毒物質(zhì)，使肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷[6-7]，研究表明降低中性粒細(xì)胞含量后，能夠改善急性肺損傷的肺損傷程度[8-9]。MPO是中性粒細(xì)胞溶酶體的特征酶，測定MPO的活性可以間接反映中性粒細(xì)胞在組織中的聚集程度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示急性肺損傷大鼠肺組織中MPO活性較高，而采用長春西汀給藥的大鼠肺組織中MPO活性顯著下降，提示長春西汀能夠降低中性粒細(xì)胞在肺組織的聚集。

NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮非常重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，如細(xì)菌脂多糖等，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與下游的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的識別位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)[10]。黏附分子存在于細(xì)胞表面，作為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)相互結(jié)合的細(xì)胞表面受體，主要參與細(xì)胞的識別、活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在免疫應(yīng)答和炎癥發(fā)生等方面具有重要作用[11]。VCAM-1通過調(diào)控單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮表面，從而促使白細(xì)胞向炎癥部位聚集，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。ICAM-1介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，促使相關(guān)抗原陽性白細(xì)胞黏附于ICAM-1陽性內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)一步到達(dá)炎癥組織，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移和趨化[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用長春西汀給藥能夠降低脂多糖引起的急性肺損傷肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平，提示長春西汀抑制NF-κB蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制黏附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)，可能與急性肺損傷的肺組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax作為細(xì)胞內(nèi)源性線粒體通路的重要調(diào)節(jié)因子，二者的蛋白表達(dá)比例對線粒體的完整性具有非常重要的作用。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)下降而Bax蛋白表達(dá)上升，會促使線粒體中的凋亡因子釋放至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引起細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性肺損傷大鼠肺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對照組，采用長春西汀給藥后明顯降低凋亡細(xì)胞數(shù)，Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)上升。提示長春西汀通過調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)與急性肺損傷肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Vinpocetine injection attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats

YE Yong-shun, LIU Hua

(TheSecondDepartmentofMedicine,FirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:Liuhuagy63@163.com)

AIM: To observe the inhibitory effects of vinpocetine injection on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) in the rats and to explore the underlying mechanisms. METHODS: Male Wistar rats (n=50) were randomly divided into 5 groups: control group, ALI model group, and low, medium and high doses of vinpocetine treatment groups. The rats in control group were injected with 0.9% NaCl at 5 mL/kg through femoral vein. The rats in ALI model group

LPS at 10 mg/kg through femoral vein. After injected with LPS, the rats in vinpocetine treatment groups received vinpocetine at 0.2 mg/kg, 0.7 mg/kg or 1.2 mg/kg via intraperitoneal injection. The pathological changes of the lung tissues were observed under microscope with HE staining. The cell apoptosis in the lung tissues was detected by TUNEL staining. Myeloperoxidase (MPO) activity was measured by the method of spectrophotometry. The protein expression of NF-κB, ICAM-1, VCAM-1, Bax and Bcl-2 was determined by Western blot. RESULTS: Compared with ALI group, administration of vinpocetine significantly attenuated the structural injury of the lung and the infiltration of inflammatory cells. Moreover, vinpocetine decreased cell apoptosis and MPO activity in the lung tissues of ALI rats. In addition, the protein expression of NF-κB, ICAM-1, VCAM-1 and Bax was inhibited after vinpocetin treatment, whereas Bcl-2 expression was increased. CONCLUSION: Vinpocetine attenuates LPS-lung injury by reducing MPO activity and regulating NF-κB, ICAM-1, VCAM-1, Bax and Bcl-2 protein expression.

Vinpocetine injection; Lipopolysaccharide; Acute lung injury

1000- 4718(2017)07- 1278- 05

2016- 11- 08

2017- 02- 16

廣東省財(cái)政技術(shù)研究開發(fā)與推廣應(yīng)用項(xiàng)目(No. 2060403)

R965； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.020

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△通訊作者 Tel: 020-61321847; E-mail： Liuhuagy63@163.com