楊國(guó)柱 段濤 盧麗 陳珺 陸幸妍 李青南

廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

桃紅四物湯源自于清代吳謙的《醫(yī)宗金鑒》由桃仁、紅花、當(dāng)歸、白芍、熟地黃、川芎等 6 味中藥組成，是遵循“活血祛瘀”的原則所組成的基本復(fù)方，在各種血栓性疾病的治療，如血管性頭痛、冠心病、血栓性靜脈炎等方面，都取得了滿意的療效[1]；又有基礎(chǔ)研究[2]表明，桃紅四物湯在骨傷科方面有一定促進(jìn)骨折愈合、改善頸椎病，腰腿痛等癥狀的作用，但其基礎(chǔ)機(jī)理和臨床應(yīng)用有待于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和研究。

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，越來(lái)越多的老年問(wèn)題也隨之出現(xiàn)。骨質(zhì)疏松癥作為影響老年人日常生活的普遍問(wèn)題之一，已得到普遍的關(guān)注和重視。在骨骼研究領(lǐng)域人們已經(jīng)成功建立了許多動(dòng)物骨骼模型，而新型模式生物斑馬魚(yú)則越來(lái)越受到人們的關(guān)注。斑馬魚(yú)個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、 胚胎透明易于觀察和操作，易于觀察骨骼的發(fā)育[3-5]，并且它的重要器官即使出現(xiàn)畸形也能存活很長(zhǎng)時(shí)間[6], 同時(shí)在研究領(lǐng)域還有些實(shí)驗(yàn)樣品用量少、實(shí)驗(yàn)周期短和可實(shí)現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)代研究表明，其骨骼形成機(jī)制與哺乳動(dòng)物一樣，且其參與調(diào)控的關(guān)鍵基因與哺乳動(dòng)物的相關(guān)基因具有高度的同源性[7]，因此斑馬魚(yú)已被廣泛用于骨骼發(fā)育及相關(guān)疾病機(jī)制的研究與治療[8-11]。

因此，本研究利用斑馬魚(yú)模型，研究中藥復(fù)方桃紅四物湯對(duì)潑尼松誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松的治療作用，為探討該復(fù)方對(duì)骨質(zhì)疏松有無(wú)療效提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥品與材料；10 μg/mL潑尼松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)28778)，依替膦酸二鈉(TargetMol，批號(hào)為T(mén)1210)，0.2% 鈣黃綠素(美國(guó)sigma公司, 批號(hào)為C0875-5G), 桃紅四物湯(桃仁9 g， 紅花6 g，當(dāng)歸12 g，川芎6 g，白芍9 g，熟地黃12 g)，每個(gè)復(fù)方大約54 g，加10倍體積的水煎煮60 min，離心取上清，經(jīng)低溫冷凍干燥成粉末狀，-80 ℃保存?zhèn)溆?。解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon公司)；6孔板(Nest Biotech)；甲基纖維素(Aladdin, Shanghai, China)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：野生型AB系斑馬魚(yú)，由浙江杭州環(huán)特生物公司提供，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后3天(3 dpf)，共180尾，用于評(píng)價(jià)桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松治療作用實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚(yú)用水中(水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μs/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(浙)2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2 方法

1.2.1桃紅四物湯的最大耐受濃度(MTC)測(cè)定：隨機(jī)選取3 dpf正常野生型AB系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔(即每濃度組)30尾，用潑尼松處理正常斑馬魚(yú)建立斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松癥模型，分別水溶給予桃紅四物湯 350、400、450和500 μg/mL 濃度，每孔容量為3 mL，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。28 ℃培養(yǎng)箱孵育一段時(shí)間后，觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)死亡數(shù)量與毒性情況，確定桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度(MTC)。

1.2.2桃紅四物湯對(duì)潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的作用：隨機(jī)選取3 dpf正常野生型AB系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔(即每濃度組)30尾，用潑尼松處理正常斑馬魚(yú)建立斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松癥模型，分別水溶給予桃紅四物湯50、150和450 μg/mL 濃度，陽(yáng)性對(duì)照藥依替膦酸二鈉 300 μg/mL 濃度，每孔3 mL 容量，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組。28 ℃ 培養(yǎng)箱孵育4 d 后，用0.2 % 鈣黃綠素進(jìn)行染色，染色后進(jìn)行拍照。采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)脊椎骨前三節(jié)的熒光強(qiáng)度(S)，桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松治療作用計(jì)算公式如下：

骨質(zhì)疏松治療作用(%)=

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐藥濃度

通過(guò)對(duì)各濃度組桃紅四物湯引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，桃紅四物湯在350、400和450 μg/mL 濃度時(shí)，斑馬魚(yú)反應(yīng)正常，均未引起斑馬魚(yú)死亡。當(dāng)濃度為500 μg/mL時(shí)，3.3 % 斑馬魚(yú)死亡，表明本實(shí)驗(yàn)中，桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐藥濃度MTC為450 μg/mL。因此，后續(xù)的骨質(zhì)疏松治療作用的實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為50、150和450 μg/mL。詳見(jiàn)表1。

表1 桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐藥濃度(n=30)Table 1 The maximum concentration of drug resistance of Taohong Siwu Decoction on zebrafish (n=30)

圖1 桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松的作用(n=30)A 潑尼松處理斑馬魚(yú)建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，設(shè)正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，桃紅四物湯三個(gè)濃度組，依替膦酸二鈉組六個(gè)處理組，分別處理4 d；B定量分析斑馬魚(yú)脊椎骨前三節(jié)的熒光強(qiáng)度。30 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用表示。與模型對(duì)照組比較，* P<0.05，** P < 0.01，***P<0.001Fig.1 Effect of different concentrations of Taohong Siwu Decoction on vertebral osteoporosis in zebrafish (n=30)A: Zebrafish osteoporosis models were established using prednisone and 6 study groups including Normal control group, Model group, Taohong Siwu Decoction groups of three different concentrations, and Etidronate disodium group received respective treatment for 4 days; B The fluorescence intensity of the first three vertebrae of zebrafish in different groups were measured using quantitative analysis.All data represent as the means±SD of thirty independent experiments.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001

圖2 桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松的治療作用(%)按公式(2.2)計(jì)算桃紅四物湯各組對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用。與模型對(duì)照組比較(圖中未列出)，*P<0.05，***P<0.001Fig.2 Therapeutic effects of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis(%).The therapeutic effects of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis were calculated according to the formula (2.2); Compared with the model group (not in the figure),*P<0.05, ***P<0.001.

2.2 桃紅四物湯對(duì)潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的作用

實(shí)驗(yàn)共有6個(gè)組，為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，依替膦酸二鈉組和3個(gè)濃度的桃紅四物湯組，作用斑馬魚(yú)模型，結(jié)果見(jiàn)圖1～2，表2。

模型對(duì)照組的斑馬魚(yú)脊椎骨熒光強(qiáng)度小于正常對(duì)照組，P<0.01；陽(yáng)性藥物依替膦酸二鈉組的斑馬魚(yú)脊椎骨熒光強(qiáng)度大于模型對(duì)照組，P<0.001，提示斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功，也表示依替膦酸二鈉對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松具有明顯的治療作用。

桃紅四物湯在濃度為50 μg/mL和150 μg/mL時(shí)，對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松治療作用分別為16.4 %和17.8 %，斑馬魚(yú)脊椎骨熒光強(qiáng)度與模型對(duì)照組比較P>0.05，提示桃紅四物湯在50 μg/mL和150 μg/mL濃度時(shí)，對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松的治療作用不明顯；但桃紅四物湯在450 μg/mL濃度時(shí)，其斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松治療作用為63.5 %，斑馬魚(yú)脊椎骨熒光強(qiáng)度與模型對(duì)照組比較P< 0.05；提示桃紅四物湯在450 μg/mL濃度時(shí)，對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松具有明顯的治療作用。

表2 桃紅四物湯對(duì)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松的治療作用(n=30)Table 2 Therapeutic effect of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis (n=30)

3 討論

桃紅四物湯作為活血化瘀類的經(jīng)典中藥復(fù)方，方中熟地、白芍是血中的血藥，當(dāng)歸、川芎是血中的氣藥，陰陽(yáng)動(dòng)靜相配，故能補(bǔ)血，又能和血，加入活血祛瘀的桃仁、紅花為主藥，突出了活血化瘀的作用，由于桃仁、紅花的活血作用比較緩和，再配合四物湯養(yǎng)血扶正，故本方是一首比較平和有效的活血祛瘀方劑[1]。中醫(yī)認(rèn)為，脈者，血之府也，凡血液流通之處，皆可稱為血府，因此桃紅四物湯也被廣泛用于骨科各疾病的治療，如骨折、腰腿痛等[2]。

由于桃紅四物湯多在骨傷科方面用做壯骨強(qiáng)腎藥的輔助用藥，單獨(dú)探討其對(duì)骨質(zhì)疏松癥作用的研究較為少見(jiàn)，本研究探討在潑尼松誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型中，桃紅四物湯對(duì)其的最大耐藥濃度和治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)潑尼松處理的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型組的基礎(chǔ)上，加入的桃紅四物湯在350、400和450 μg/mL 濃度時(shí)，斑馬魚(yú)反應(yīng)正常，未有死亡。而在500 μg/mL 濃度時(shí)引起3.3%斑馬魚(yú)死亡，即本方對(duì)斑馬魚(yú)的MTC為450 μg/mL，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了陽(yáng)性對(duì)照藥和桃紅四物湯的抗骨質(zhì)疏松活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依替膦酸二鈉的抗骨質(zhì)疏松的作用略強(qiáng)于桃紅四物湯，而桃紅四物湯的療效存在著一定的量效關(guān)系，另一方面，提示斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型也可用于中藥復(fù)方抗骨質(zhì)疏松活性的療效關(guān)系研究。

由于斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型是一種介于單細(xì)胞和整體哺乳動(dòng)物之間的在體模式動(dòng)物模型，可作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)之間的橋梁，體積小而有完整骨骼，可實(shí)現(xiàn)在體、無(wú)損傷地快速觀察藥物的作用。這對(duì)開(kāi)發(fā)我國(guó)豐富的中藥資源，尤其是能夠快速地發(fā)現(xiàn)和甄別具有抗骨質(zhì)疏松作用或骨骼毒副作用的某些經(jīng)典復(fù)方[12]，有著不可否認(rèn)的促進(jìn)作用。