柳辰玥 趙保勝 劉海霞 朱如愿 王麗麗 馬如風(fēng) 李琳 陳貝貝 顧小盼 潘勃 吳臻 張東偉

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心，北京 100029

骨質(zhì)疏松是一種以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，并致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的慢性代謝性骨骼疾病[1]，受遺傳和環(huán)境因素共同影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)一段時(shí)間后，骨形成減少和骨吸收增加，骨吸收和骨形成動(dòng)態(tài)平衡被打破[3]，骨量明顯減少[4-7]，造成骨質(zhì)疏松。

臨床研究也發(fā)現(xiàn)，服用磺脲類降糖藥的患者骨折發(fā)生率降低[8]，但關(guān)于磺脲類降糖藥對(duì)高脂飲食患者骨重建的影響及其作用機(jī)理，目前尚無詳細(xì)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食造成ApoE-/-小鼠骨質(zhì)疏松為對(duì)象，探索格列美脲對(duì)其骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)的影響及可能的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：Olympus BX53 倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。RM2255 Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國Leica公司。博勒飛質(zhì)構(gòu)儀CT3，美國Brookfield公司。

1.1.2藥品與試劑：格列美脲片，賽諾菲(北京)制藥有限公司，批號(hào)：4JB061。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)，北京市化學(xué)試劑公司。Fast Green，美國Sigma公司。Safrain O，美國Sigma公司。骨組織抗原修復(fù)液，上海舜百生物科技有限公司。免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物公司，批號(hào)：K152411A。DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物公司，批號(hào)：K166913B。Cathepsin K(ab19027)，Abcam公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6和ApoE-/-小鼠，體重18～20 g，購自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，并飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0024，室溫22 ℃，相對(duì)濕度55%，光暗周期12 h/12 h，自由飲水、飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1分組及給藥：實(shí)驗(yàn)時(shí)分別采用C57BL/6和ApoE-/-小鼠。其中，8 只野生型 C57BL/6 小鼠為野生正常組，ApoE-/-小鼠24只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為ApoE-/-正常組、ApoE-/-高脂組和格列美脲組，每組8只。ApoE-/-高脂組和格列美脲組小鼠給予高脂飲食(含75%基礎(chǔ)飼料，2%膽固醇，23%豬油)，野生正常組和ApoE-/-正常組給予普通飼料。格列美脲組灌服格列美脲(25 mg/kg)水溶液，其余各組分別給予等量去離子水。

1.2.2取材及樣品制備：給藥6周后，用1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)腹腔麻醉處死小鼠，分離兩側(cè)股骨，剔除肌肉組織，其中一側(cè)股骨用蘸生理鹽水的紗布包裹，放于-80 ℃?zhèn)溆谩⒘硪粋?cè)的股骨置于10%中性福爾馬林，固定72 h后，15% EDTA(pH 7.4)脫鈣，脫鈣液每2周換1次，連續(xù)脫鈣3個(gè)月。股骨組織脫鈣后，自來水沖水過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，采用Leica切片機(jī)進(jìn)行組織切片，厚度為5 μm，40 ℃溫水展片，60 ℃烘干，4 ℃保存待用。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

(1) H&E染色：按照郭魚波等[1]的染色方法：將股骨切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色7 min，自來水沖洗，分色液分色1 min，去離子水浸洗，伊紅染色3 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后置于Olympus BX53倒置顯微鏡下觀察病理形態(tài)并拍照。

(2) Safrain O/Fast Green染色：參考馬如風(fēng)等[9]的方法，簡述如下：將股骨石蠟切片60 ℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗3 min，1% HCl-Alc分化2 s，去離子水洗3次，0.05% Fast Green染5 min后用1%醋酸洗30 s，0.1% Safrain O染5 min后用95%乙醇洗3次，100%乙醇洗2次，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各30 min，中性樹膠封片后拍照并用Image pro plus 6.0分析，計(jì)算灰度值(IOD)。

(3) 骨生物力學(xué)的測(cè)定：采用博勒飛質(zhì)構(gòu)儀CT3測(cè)定骨生物力學(xué)。實(shí)驗(yàn)時(shí)使股骨生理彎曲向上放置于跨距為7 mm的兩個(gè)支撐點(diǎn)上，進(jìn)行3點(diǎn)彎曲測(cè)試，探頭下降速度為10 mm/min，至股骨斷裂后繼續(xù)運(yùn)行2 mm停止，根據(jù)探頭下降的距離、載荷以及骨斷端直徑，計(jì)算股骨的第一循環(huán)硬度、峰值壓力和硬度形變量。

(4) 免疫組化測(cè)股骨Cathepsin K表達(dá)量：參考王麗麗等[10]的方法，簡述如下：將股骨石蠟切片60 ℃烤片2 h后常規(guī)脫蠟至水，然后滴加骨組織抗原修復(fù)液，37 ℃孵育30 min后，依次滴加3% H2O2，0.04% Triton×100，10%山羊血清封閉后，加一抗Cathepsin K(比例1:50)，4 ℃孵育過夜。加免疫組化二抗37 ℃孵育30 min后，PBS洗3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染后自來水沖洗，脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照并用Image pro plus 6.0分析，計(jì)算IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 格列美脲對(duì)高脂飲食小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，H&E染色鏡下觀察，野生正常組小鼠骨骺端骨小梁排列整齊。與ApoE-/-正常組相比，ApoE-/-高脂組小鼠骨骺端稀疏，骨小梁排列紊亂、變細(xì)、斷裂。與ApoE-/-高脂組小鼠相比，格列美脲組小鼠骨微結(jié)構(gòu)得到改善，骨小梁排列整齊、增粗，但仍然未恢復(fù)到正常狀態(tài)。

圖1 小鼠股骨H&E染色 (×100)Fig.1 H&E staining of femurs in mice (×100)

如圖2所示，在Fast Green染的綠色背景上，Safrain O把糖胺聚糖染成紅色。野生正常組小鼠骨骺端糖胺聚糖含量多且分布均勻。與野生正常組小鼠相比，ApoE-/-正常組小鼠股骨糖胺聚糖含量無明顯差異，ApoE-/-高脂組小鼠股骨糖胺聚糖含量顯著減少(P<0.01)。與ApoE-/-高脂組相比，格列美脲連續(xù)治療6周后，股骨糖胺聚糖含量明顯增加(P<0.01)。

圖2 Safrain O/Fast Green 染色與野生正常組比,# P<0.05,## P<0.01；與ApoE-/-高脂組比，*P<0.05, ** P<0.01Fig.2 Safrain O/Fast Green Staining #P <0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, **P<0.01 vs ApoE-/- HFD

2.2 格列美脲對(duì)高脂飲食小鼠骨生物力學(xué)影響

如圖3所示，與野生正常組小鼠相比，ApoE-/-正常組小鼠股骨第一循環(huán)硬度、峰值壓力和硬度形變量均無明顯改變，ApoE-/-高脂組小鼠股骨第一循環(huán)硬度、峰值壓力和硬度形變量均顯著降低(P<0.05或0.01)；與ApoE-/-高脂組相比，經(jīng)格列美脲連續(xù)治療6周后，第一循環(huán)硬度、峰值壓力和硬度形變量均明顯升高(P<0.05或0.01)。

圖3 格列美脲對(duì)骨生物力學(xué)影響與野生正常組比,# P<0.05,##P<0.01；與ApoE-/-高脂組比，*P<0.05, **P<0.01Fig.3 Effect of Glimepiride on bone microarchitecture #P <0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, **P<0.01 vs ApoE-/- HFD

2.3 格列美脲對(duì)高脂飲食小鼠的股骨Cathepsin K表達(dá)量的影響

研究證明，Cathepsin K與破骨細(xì)胞活性密切相關(guān)，且多在破骨細(xì)胞中表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與野生正常組小鼠相比，ApoE-/-正常組和ApoE-/-高脂組小鼠骨骺端Cathepsin K表達(dá)量均升高(P<0.05，0.01)；與ApoE-/-高脂組相比，格列美脲組小鼠骨骺端Cathepsin K的表達(dá)量降低(P<0.05)。

圖4 免疫組化染色測(cè)定小鼠股骨Cathepsin K的表達(dá)藍(lán)色圈出部分為陽性表達(dá)，箭頭所指部分為400倍放大的對(duì)應(yīng)位置與野生正常組比,# P<0.05,## P<0.01；與ApoE-/-高脂組比，* P<0.05, ** P<0.01Fig.4 Immunohistochemical staining showed Cathepsin K expression in mice femurs, the part of blue circle was positive expression, the arrow pointing part is the corresponding position of x400 magnified#P<0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, ** P<0.01 vs ApoE-/- HFD

3 討論

遺傳因素是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要因素，多項(xiàng)遺傳基因被視為骨質(zhì)疏松的候選基因，載脂蛋白E(ApoE)基因是其中之一[2]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘發(fā)ApoE-/-小鼠骨量減少，說明高脂可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠骨質(zhì)疏松。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高脂飲食導(dǎo)致ApoE-/-小鼠的骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨生物力學(xué)性能下降，骨強(qiáng)度下降，骨吸收增強(qiáng)。

格列美脲是第三代磺酰脲類降糖藥，有研究表明，格列美脲可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[12]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，格列美脲連續(xù)治療6周，可以促進(jìn)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠骨量增加，骨微結(jié)構(gòu)改善，宏觀上表現(xiàn)為骨第一循環(huán)硬度、峰值壓力、硬度形變量，改善骨生物力學(xué)性能。Safrain O/Fast Green染色可以看出：高脂組小鼠骨組織中，糖胺聚糖含量減少，而格列美脲逆轉(zhuǎn)了這種改變，促進(jìn)了糖胺聚糖生成，從而促進(jìn)骨形成。

Cathepsin K是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，可以降解骨基質(zhì)蛋白，其主要在破骨細(xì)胞中表達(dá)[13]。研究證明，Cathepsin K與破骨細(xì)胞活性密切相關(guān)，Cathepsin K表達(dá)越多，破骨細(xì)胞活性越強(qiáng)，從而促進(jìn)骨吸收，因此，抑制Cathepsin K活性可改善骨質(zhì)疏松[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，格列美脲連續(xù)治療6周后Cathepsin K表達(dá)量增多。本實(shí)驗(yàn)研究證明，高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠經(jīng)格列美脲連續(xù)治療6周后，骨骺端Cathepsin K表達(dá)降低，推測(cè)格列美脲可以抑制骨吸收，從而使骨吸收和骨形成達(dá)到平衡，向成骨方向轉(zhuǎn)變，其機(jī)制可能與抑制Cathepsin K的表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠產(chǎn)生骨質(zhì)疏松，經(jīng)格列美脲連續(xù)治療6周后，骨微結(jié)構(gòu)得到改善，骨小梁排列整齊，骨強(qiáng)度增加，骨吸收降低，骨質(zhì)疏松得到明顯改善，其作用機(jī)制可能與抑制Cathepsin K的表達(dá)有關(guān)。