楊國(guó)曦 朱慶生 楊重飛

第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨一科, 陜西 西安 710032

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是本世紀(jì)發(fā)展最成功的術(shù)式之一，然而，無(wú)菌性松動(dòng)造成的術(shù)后翻修給患者造成生活質(zhì)量的下降和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。作為人體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，破骨細(xì)胞對(duì)骨量的維持以及骨形態(tài)的塑造具有非常重要的作用[2-4]。假體磨損而產(chǎn)生的磨損顆?？梢源龠M(jìn)破骨細(xì)胞的分化，造成假體周圍骨溶解，進(jìn)一步發(fā)展則會(huì)引起無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生，并最終導(dǎo)致翻修，因此，研究破骨細(xì)胞分化的機(jī)制對(duì)無(wú)菌性松動(dòng)的預(yù)防和治療具有十分重要的意義。破骨細(xì)胞由單核/巨噬細(xì)胞分化而來(lái)，其分化成熟的過(guò)程亦是細(xì)胞遷徙和融合的過(guò)程，巨噬細(xì)胞分化抗原-1(Macrophage differentiation antigen-1，Mac-1)分子作為整合素家族的重要一員，除了參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，也參與細(xì)胞間識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。與Mac-1(CD11b/CD18)分子僅有一個(gè)亞基之差的LFA-1(CD11a/CD18)和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的ICAM-1(CD54)的相互作用對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有明顯的促進(jìn)作用[6-8]，而目前尚無(wú)Mac-1在RANKL誘導(dǎo)下破骨細(xì)胞導(dǎo)致骨溶解的相關(guān)研究，因此，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)建立超高分子聚乙烯磨損顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解模型，模擬無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生過(guò)程，并探討CD11b分子在顱骨溶解過(guò)程中發(fā)揮的作用及初步分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

C57BL/6J清潔級(jí)小鼠，10周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鱟試劑內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒(Endosafe，美國(guó))；超高分子聚乙烯(Ultrahigh molecular weight polyethylene，UHMWPE)磨損顆粒顆粒由德國(guó)ErnstKrendlinger教授惠贈(zèng)(CeridustVP3610，Clariant，Gersthofen,Germany)50%的顆粒直徑小于5 μm，90%的顆粒直徑小于9 μm，平均直徑為1.68±1.32 μm；小鼠TNF-α ElISA試劑盒(R&D，美國(guó))；anti-CD11b單克隆抗體(M1/70，Abcam，美國(guó))，Syk抑制劑(P505-15,Selleck，美國(guó))。顯微計(jì)算機(jī)體層攝影(General Electric Company，美國(guó))；注射器；常規(guī)手術(shù)器械(手術(shù)刀、剪血管鉗等)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型建立：術(shù)前將UHMWPE磨損顆粒用700 mg/L乙醇洗滌24 h，采用鱟檢驗(yàn)排除細(xì)菌內(nèi)毒素水平超標(biāo)，磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，干燥后用Co60照射消毒，并用PBS溶液稀釋為40 μg/mL懸濁液。

取10周齡雌性C57BL/6J小鼠32只，分為4組，每組8只，稱量體重并做標(biāo)記。10%水合氯醛麻醉，經(jīng)外耳根內(nèi)側(cè)部連線的中點(diǎn)和眼眶后部連線的中點(diǎn)之間連線作矢狀位切口長(zhǎng)約 1.5 cm，暴露額狀縫及人字縫間直徑約 1 cm 的顱頂骨面積，并保持骨膜完整性?？瞻讓?duì)照組(A)隨即縫合不做任何處理(假手術(shù)組)；其余三組以暴露的矢狀縫中點(diǎn)為中心，在顱骨骨膜外移植20 μg UHMWPE磨損顆粒(0.5 mL 濃度為40 μg/mL的顆粒PBS懸濁液)，隨后間斷縫合。術(shù)后待小鼠清醒后送入飼養(yǎng)籠中，動(dòng)物自由攝取食物和水，飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房中。術(shù)后第二天開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)：空白對(duì)照組(A)灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次；Syk抑制劑組(B)以灌胃針頭灌胃Syk抑制劑(P505-15)，15 mg/kg(濃度為0.4 mg/mL的P505-15生理鹽水溶液)，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次；anti-CD11b單克隆抗體組尾靜脈注射anti-CD11b單抗，2 g/kg[9](濃度為200 mg/mL的抗體PBS溶液)，每日1次，并灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次；顆粒組(D)灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次。2周后，頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球取血，取出顱骨標(biāo)本。血液離心后用TNF-αELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α濃度，顱骨標(biāo)本進(jìn)行顯微CT掃描重建并檢測(cè)相同部位等面積感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)的骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BVF)，若BVF值低于空白對(duì)照組(P<0.05)，并具備明顯的骨溶解征象，則判定為建模成功。

1.2.2Western blot 分析：提取各組顱骨骨膜總蛋白。依次進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，分別孵育兔抗小鼠一抗(1∶1 000)及羊抗兔二抗(1∶5 000)后，ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光并顯影。采用Image J軟件進(jìn)行掃描定量，計(jì)算各條帶灰度值，并分別除以內(nèi)參β-actin灰度值，并將對(duì)照組設(shè)為參照。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清TNF-α濃度

空白對(duì)照組、anti-CD11b單克隆抗體組及Syk抑制劑組血清TNF-α值均低于顆粒組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 顯微CT三維重建

建模小鼠全部存活，平均體重26.6 g?？瞻讓?duì)照組圖像可見(jiàn)完整顱骨，未見(jiàn)顱骨溶解跡象；Syk抑制劑組骨溶解程度較顆粒組輕，只出現(xiàn)小部分缺損；anti-CD11b單克隆抗體組出現(xiàn)輕微顱骨溶解及骨缺損；顆粒組出現(xiàn)嚴(yán)重顱骨溶解，出現(xiàn)大面積缺損。見(jiàn)圖1。

組別(Group)濃度(μg/mL)(Concentration:μg/mL)空白對(duì)照組(Control)1.025±0.002Syk抑制劑組(Syk inhibitor group)1.145±0.003a,bAnti-CD11b單抗治療組(Anti-CD11b antibody group)1.202±0.002a,b顆粒組(Particles group)1.478±0.006a

注：a：與空白對(duì)照組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

圖1 小鼠顱骨溶解模型顯微CT三維重建結(jié)果(圓形紅色區(qū)域?yàn)镽OI)A：空白對(duì)照組; B：Syk抑制劑組; C：Anti-CD11b單克隆抗體組; D：顆粒組Fig.1 Micro—CT three-dimensional reconstruction of mouse osteolysis model (red circular area areas refer to ROI)A:Control, B:Syk inhibitor group, C:Anti-CD11b antibody group, D:Particles group

2.3 小鼠顱骨骨體積分?jǐn)?shù)

顆粒組骨體積分?jǐn)?shù)小于空白對(duì)照組(P<0.05),可知超高分子聚乙烯顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解模型建模成功；Syk抑制劑組、anti-CD11b單克隆抗體組骨體積分?jǐn)?shù)大于顆粒組(P<0.05)，可知Syk抑制劑及anti-CD11b單克隆抗體均對(duì)顆粒誘導(dǎo)的顱骨溶解有一定的抑制作用。見(jiàn)表2。

2.4 western blot 分析

Syk抑制劑組及anti-CD11b單克隆抗體組Erk活性、c-fos及NFATc1表達(dá)均低于顆粒組而高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

組別(Group)N骨體積分?jǐn)?shù)(Bone volume fraction)空白對(duì)照組(Control)80.1402±0.0012Syk抑制劑組(Syk inhibitor group)80.1135±0.0009a,bAnti-CD11b單抗治療組(Anti-CD11b antibody group)80.0902±0.0010a,b顆粒組(Particles group)80.0602±0.0008a

注：a：與空白對(duì)照組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

圖2 Western blot 結(jié)果Fig.2 Western blot results

表3 Western blot 半定量結(jié)果Table 3 Western blot semi-quantitative results

注：a：與空白對(duì)照組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，Erk: extracellular signal-regulated kinas,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶,NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1,活化T細(xì)胞核因子1。
a：P<0.05 vs control,b:P<0.05 vs particles group，Erk: extracellular signal-regulated kinas，NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1.

3 討論

無(wú)菌性松動(dòng)可引起關(guān)節(jié)置換術(shù)后疼痛和功能障礙，并最終導(dǎo)致翻修，是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最重要的慢性并發(fā)癥之一[10]。盡管無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生受多種因素的影響，但磨損顆粒依然是其最重要的起始原因[11]，金屬對(duì)UHMWPE是目前人工關(guān)節(jié)假體摩擦界面中最主要的一種，所產(chǎn)生的UHMWPE磨損顆粒也是臨床上最常見(jiàn)的磨損顆粒之一[10]，在無(wú)菌性松動(dòng)的病理發(fā)展過(guò)程中，磨損顆粒刺激多種細(xì)胞因子的分泌，例如TNF-α、IL-1和IL-6，進(jìn)而促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的募集、分化、激活和存活，導(dǎo)致假體周圍骨溶解的發(fā)生[10]，最終降低假體生存率。

CD11b是構(gòu)成Mac-1分子的兩種亞基之一[12-14]，而位于破骨前體細(xì)胞表面的Mac-1分子具有多種功能：第一，介導(dǎo)白細(xì)胞與NK細(xì)胞的游走與滲出；第二，介導(dǎo)白細(xì)胞與NK細(xì)胞對(duì)iC3b調(diào)理的微生物或靶細(xì)胞的細(xì)胞毒功能；第三，結(jié)合胞外多種糖蛋白分子，介導(dǎo)跨膜傳導(dǎo)，影響破骨細(xì)胞的分化[15]。在Mac-1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和信號(hào)傳導(dǎo)中，CD11b亞基起到主導(dǎo)作用，而不是另一亞基CD18[16]，因此推測(cè)anti-CD11b單克隆抗體可能影響顆粒誘導(dǎo)骨溶解的病理過(guò)程。在破骨細(xì)胞分化的初期階段，Mac-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在破骨前體細(xì)胞分化至抗酒石酸磷酸酶陽(yáng)性及細(xì)胞遷徙到融合階段都具有非常重要的作用[17]，該分子通過(guò)胞漿部分免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)調(diào)節(jié)銜接蛋白DAP(DNAX-activating protein，DNAX活化蛋白)12 和FcRγ(Fc receptorγ，F(xiàn)c受體γ)傳遞信號(hào)激活Syk通路，從而進(jìn)一步激活Ca2+信號(hào)，上調(diào)NFATc1轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[18]。本實(shí)驗(yàn)中anti-CD11b單克隆抗體組及Syk抑制劑組骨體積分?jǐn)?shù)較顆粒組高，說(shuō)明anti-CD11b單克隆抗體及Syk抑制劑對(duì)顆粒誘導(dǎo)的骨溶解具有抑制作用，而western blot結(jié)果顯示anti-CD11b單抗或Syk抑制劑處理均導(dǎo)致Syk下游Erk通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明CD11b分子通過(guò)激活下游Syk通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。

TNF-α是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，病原體、內(nèi)毒素等物質(zhì)可以刺激該因子的產(chǎn)生。在骨代謝和炎癥性骨病中，TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和存活，扮演著十分重要的角色。Christine Lau等[19]發(fā)現(xiàn)，Syk通過(guò)調(diào)控p38的磷酸化，參與核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子的激活，最終促進(jìn)TNF-α的分泌，在炎癥的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。Shinohara H等[20]發(fā)現(xiàn)依賴雙鏈RNA的蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)在TNF-α刺激的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中具有十分重要的地位，通過(guò)對(duì)RAW264.7細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TNF-α處理后，破骨細(xì)胞內(nèi)PKR升高，而PKR特異性抑制劑處理破骨前體細(xì)胞后，TNF-α所引起的促破骨細(xì)胞分化作用被減弱了，且這種作用是通過(guò)降低NFATc1而引起的。同時(shí)，TNF-α可以增加破骨前體細(xì)胞表面RANK的表達(dá)，同時(shí)激活基質(zhì)細(xì)胞和骨基質(zhì)脂肪細(xì)胞分泌RANKL[21]，而RANKL和RANK的相互作用促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化過(guò)程[22, 23]，進(jìn)一步說(shuō)明TNF-α具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而加劇骨溶解的作用。在外界環(huán)境所導(dǎo)致的炎癥刺激下，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，iNOS)和NO生成增加，在TNF-α刺激下，iNOS在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均明顯上升，同時(shí)，在細(xì)胞包漿內(nèi)和培養(yǎng)基中均檢測(cè)到NO升高，Lee SK等[24]發(fā)現(xiàn)iNOS特異性抑制劑可以抑制TNF-α對(duì)破骨細(xì)胞存活的促進(jìn)作用，同時(shí)增加培養(yǎng)基內(nèi)NO濃度可以緩解這種抑制作用，這表明TNF-α通過(guò)增加破骨細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)，增加NO的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的存活。TNF-α亦可以通過(guò)Erk1/2 p44 途徑誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞表面Mac-1 分子的表達(dá)上調(diào)，并介導(dǎo)其向慢性炎癥反應(yīng)部位游走[25]，而Mac-1的CD11b亞基可以通過(guò)激活Syk通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，由此說(shuō)明TNF-α不僅發(fā)揮促破骨細(xì)胞形成的作用，同時(shí)可以上調(diào)CD11b分子，協(xié)同刺激破骨細(xì)胞成熟。本實(shí)驗(yàn)中，顆粒組小鼠血清TNF-α較其余三組升高，提示UHMWPE顆粒刺激機(jī)體產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨溶解的發(fā)生，而Syk抑制劑組及anti-CD11b單克隆抗體組小鼠血清TNF-α較顆粒組小鼠降低，說(shuō)明anti-CD11b單克隆抗體可以通過(guò)下游Syk通路抑制TNF-α的產(chǎn)生，降低該細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞分化及存活的促進(jìn)作用，協(xié)同anti-CD11b抗體本身所發(fā)揮的阻礙破骨細(xì)胞分化效應(yīng)，最終共同抑制了磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。

綜上所述， anti-CD11b單克隆抗體通過(guò)封閉CD11b分子，干擾Syk通路的激活并降低TNF-α的產(chǎn)生，使破骨細(xì)胞分化受阻，最終抑制UHMWPE磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解，提示CD11b分子或可作為關(guān)節(jié)置換術(shù)后無(wú)菌性松動(dòng)的潛在治療靶點(diǎn)。