宗群川 王濤

青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，青海 西寧 810000

H2S作為一種氣體化合物，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是活生物體的毒性試劑，然而在真核生物發(fā)現(xiàn)也可以合成后，H2S逐漸得到大家的關(guān)注。目前，H2S被認(rèn)為是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種重要的氣體信號分子，在循環(huán)系統(tǒng)、胃腸道、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用[1]。H2S由機(jī)體多種細(xì)胞和宿主微生物產(chǎn)生，內(nèi)源性H2S以L-半胱氨酸為底物，由胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(CSE)[2]為主要的酶機(jī)制催化產(chǎn)生(見圖1)，其他如3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(MST)和半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)在特定組織類型中也很重要。CSE在周圍組織中比CBS更重要，CBS在腦中占主導(dǎo)地位[3]，也有認(rèn)為CBS和3-MST主要存在于腦中，CSE主要與外周或非神經(jīng)組織相關(guān)。現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)所有三種酶是普遍存在的，所以H2S幾乎影響所有細(xì)胞過程[4]。H2S在體內(nèi)有未解離的H2S和解離的HS-兩種狀態(tài)，兩者之間保持動態(tài)平衡，而NaHS 作為外源性H2S供體已應(yīng)用于相關(guān)研究當(dāng)中。

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨密度降低，骨微結(jié)構(gòu)受到破壞以及骨中的多種蛋白質(zhì)被改變?yōu)樘卣鞯某Ｒ姷墓趋兰膊。鰪?qiáng)了骨折的風(fēng)險。其較高的發(fā)病率和死亡率，使骨質(zhì)疏松性骨折面臨著衛(wèi)生保健的嚴(yán)峻問題，尤其是老年女性和男性[5]。雌激素缺乏引起的絕經(jīng)期女性骨質(zhì)疏松癥至關(guān)重要[6]。此外，長期使用糖皮質(zhì)激素和遺傳因素等都可以成為導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的因素。隨著H2S在機(jī)體循環(huán)、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等新型功能的發(fā)現(xiàn)，H2S調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的作用成為當(dāng)代研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)H2S在保持成骨細(xì)胞(OB，骨代謝細(xì)胞)和破骨細(xì)胞(OC，骨橋蛋白細(xì)胞)平衡的精細(xì)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。絕經(jīng)后和長期使用糖皮質(zhì)激素等導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的病因研究中均已明確H2S的重要地位，通過H2S的控制來調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的動態(tài)平衡成為骨質(zhì)疏松癥研究的熱點(diǎn)。

1 H2S與不同病因骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究

1.1 H2S與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與雌激素水平下降明顯相關(guān)，而H2S成為兩者相互影響的的橋梁。H2S的產(chǎn)生與人體類固醇激素保持密切的聯(lián)系，研究證明類固醇可以調(diào)節(jié)H2S的生物合成，其中雌激素直接調(diào)節(jié)人類破骨細(xì)胞(SCs)中的CBS和CSE的mRNA水平，基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的H2S可刺激成骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生，故雌激素通過對H2S的影響調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的平衡[7]。Francesco等[8]研究證實，卵巢切除(OVX)骨量丟失模型中，H2S生成酶CBS和CSE受到抑制，血清和骨髓中H2S水平降低。此外，H2S有預(yù)防氧化應(yīng)激的作用[9]，雌激素的丟失可降低H2S水平，從而導(dǎo)致機(jī)體對氧化應(yīng)激的防御減弱[10]，加速了骨骼衰老。因此，H2S的刺激成骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生及預(yù)防氧化應(yīng)激的作用，提示H2S的減少介導(dǎo)或加強(qiáng)了雌激素缺乏與骨中氧化應(yīng)激的作用對骨老化的影響。

另有研究發(fā)現(xiàn)，通過GYY4137(水溶性H2S的緩釋供體)的治療可使OVX小鼠中的血清H2S正?；?，GYY通過激活Wnt信號增加了基質(zhì)細(xì)胞中的Wnt配體，如Wnt16(Wnt16誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)，阻止皮質(zhì)骨脆性骨折和抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生[11])，亦可增加骨形成來防止骨小梁和皮質(zhì)骨損失，因此GYY可能是皮質(zhì)骨合成代謝過程的的必要介質(zhì)，H2S或可參與調(diào)節(jié)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

1.2 H2S與長期使用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的研究

糖皮質(zhì)激素(GC)的使用可以直接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞死亡和凋亡[12]。長期使用GC的骨組織學(xué)圖像顯示成骨細(xì)胞數(shù)量減少和成骨細(xì)胞凋亡水平增加，即患者易患骨質(zhì)疏松癥[13]。重要研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松(Dex)刺激的骨質(zhì)疏松組織的MC3T3-E1細(xì)胞中，CBS和CSE顯著下調(diào)。因此，GC的長期使用導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥與H2S產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象存在著密切關(guān)系。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體NaHS可激活A(yù)MPK信號傳導(dǎo)并抑制MC3T3-E1細(xì)胞損傷，同時H2S保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞免受H2O2介導(dǎo)的氧化損傷[14]。其中H2S在MC3T3 E1細(xì)胞中依賴AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)的激活介導(dǎo)細(xì)胞的保護(hù)活性，故AMPK信號可能是由H2S激活的關(guān)鍵信號分子[15,16]，在Dex導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥中對MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)揮著保護(hù)作用。探究其中機(jī)制發(fā)現(xiàn)，AMPK可調(diào)節(jié)ATP內(nèi)穩(wěn)態(tài)的同時促進(jìn)NADPH合成，減弱氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷并限制其消耗。AMPK/ACC(乙酰輔酶A羧化酶)信號軸作為抗氧化劑來維持ATP/NADPH體內(nèi)平衡，并從氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中拯救細(xì)胞[17]。Zhou等[18]表示AMPK還可以激活自噬系統(tǒng)抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。類似的，Jeon等[19]發(fā)現(xiàn)AMPK激活劑(A-769662)保護(hù)成骨細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的凋亡。

2 H2S預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究

2.1 H2S與氧化應(yīng)激作用的相關(guān)研究

老年男性和女性的氧化應(yīng)激增加與骨形成減少密切相關(guān)，據(jù)報道，H2O2誘導(dǎo)各種類型細(xì)胞的凋亡或壞死[20]。活性氧(ROS)抑制成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖和/或分化及鈣化過程，降低成骨細(xì)胞的骨形成，破壞纖連蛋白基質(zhì)[21]。老年骨質(zhì)疏松的婦女中也發(fā)現(xiàn)血漿抗氧化劑顯著減少[22]。CSE和CBS酶的底物L(fēng)-半胱氨酸，可以保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的損傷。同時，數(shù)據(jù)表示H2S的內(nèi)源性和外源性應(yīng)用可以保護(hù)成骨細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。

研究發(fā)現(xiàn)H2S可以逆轉(zhuǎn)由H2O2抑制的mRNA水平和ALP(堿性磷酸酶)的活性，NaHS抑制osterix(osterix基因激活上調(diào)骨基質(zhì)蛋白骨鈣素)表達(dá)，從而顯著逆轉(zhuǎn)H2O2，但對Runx2(Runx2基因作用效果同osterix)沒有影響。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)H2S影響成骨細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)。Banerjee等[24]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中可以產(chǎn)生TNF-α和NO及某些局部因子使H2O2產(chǎn)生上調(diào)，而H2S可以預(yù)防由H2O2引起的MC3T3-E1細(xì)胞膠原蛋白的丟失，NaHS的應(yīng)用可以抑制了H2O2誘導(dǎo)TNF-α和NO產(chǎn)生的過程。同時H2S可通過抑制p38 MAPK(促分裂素原活化蛋白激酶)逆轉(zhuǎn)H2O2受損的SOD(超氧化物歧化酶)活性，p38 MAPK的活化降低了幾種組織中的SOD活性，H2S亦可以通過MAPK依賴機(jī)制的抗氧化作用保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞免受H2O2的損傷。

2.2 H2S調(diào)節(jié)Ca2+通道影響骨間質(zhì)細(xì)胞(BMMSC)和骨密度

高同型半胱氨酸血癥與CBS缺陷患者相似具有多種表現(xiàn)，如近視、外差、智力遲鈍、血栓栓塞性疾病和骨質(zhì)疏松的經(jīng)典臨床特征[25]。在Liu等[7]研究中，發(fā)現(xiàn)H2S并非通過提高HCY水平發(fā)揮作用，同時HCY治療不能誘導(dǎo)BMMSC損傷。有試驗表明高同型半胱氨酸(HCY)水平可以刺激破骨細(xì)胞活性增加[26]。研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的H2S通過BMMSCs中的多個TRP通道的硫酸化維持細(xì)胞間Ca2 +體內(nèi)平衡。與人體中的經(jīng)典信號分子不同，氣體信號分子是具有自由滲透膜的獨(dú)特能力的目標(biāo)特異性分子，H2S水平的降低導(dǎo)致BMMSC中的級聯(lián)反應(yīng)，包括改變的Ca2+通道巰基化，Ca2+內(nèi)流，Wnt /β級聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和成骨分化，最終的結(jié)果是骨質(zhì)疏松癥表型。但不同Ca2+通道的H2S控制的機(jī)制是未知的。因此，針對H2S缺陷相關(guān)疾病，早期了解H2S的作用機(jī)制對H2S供體療法的研究進(jìn)展有著重要的作用[27]。

2.3 H2S對骨質(zhì)疏松影響因素金屬蛋白酶(MMP)的相關(guān)研究

骨微血管重塑是骨結(jié)構(gòu)和功能的主要預(yù)測因子。血管壁中50%的總蛋白是彈性蛋白，在重塑期間，彈性蛋白由特異性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)降解，被更硬的膠原蛋白替代(彈性蛋白的周轉(zhuǎn)比膠原蛋白的周轉(zhuǎn)慢1000倍)。組成性重塑的平衡對于骨的結(jié)構(gòu)和功能是必要的。MMP的降解可引發(fā)各種病理狀況，包括骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎和心血管疾病。Thomas 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨著H2S從16μmol/L開始持續(xù)增加至40μmol/L，MMP活性降低。這與當(dāng)前的認(rèn)為較低的H2S的生理濃度是有益的觀點(diǎn)一致。有趣的是，硝普鈉(NO的供體)濃度為1μmol/L時MMP活性增加，MMP活性呈指數(shù)增加，硝普鈉3μmol/L能夠克服在H2S 40μmol/L下發(fā)生的MMP活性的降低，導(dǎo)致MMP活性的更顯著的指數(shù)增加。H2S抑制MMP的活化及氧化應(yīng)激引起的膠原螺旋的破壞，NO通過與超氧化物結(jié)合并形成過氧亞硝酸鹽促進(jìn)氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)MMP活化和破壞膠原螺旋。H2S和NO之間存在復(fù)雜的作用在體內(nèi)可能不相同，故在今后的研究需要該平衡在臨床上有利的方向傾斜。

3 H2S抵制骨質(zhì)疏松癥與氧化還原酶SQRDL I264T的相關(guān)研究

骨質(zhì)疏松癥和/或骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性狀的易感性基因/基因座通過基于基因的關(guān)聯(lián)研究大量被發(fā)現(xiàn)[29]。然而，只有少部分基因研究了其在骨重塑的功能機(jī)制[29]。由于疾病中最常見變異體的效應(yīng)很小或不大[29]，很難證明遺傳變異體在疾病表型中的功能效果。Lagoutte等[30-32]研究發(fā)現(xiàn)并證明了H2S催化氧化還原酶SQRDL I264T變體對前骨MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化的重要作用。SQRDL在線粒體中表達(dá)，并且通過在線粒體H2S代謝過程的第一步驟中催化H2S的氧化來調(diào)節(jié)細(xì)胞H2S水平，并且SQRDL蛋白可在多個組織中表達(dá)[30,31]。過表達(dá)SQRDL I264T變體的前骨原MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化明顯好于過表達(dá)WT SQRDL細(xì)胞的成骨細(xì)胞的分化。H2S對骨重塑的已知作用可以解釋當(dāng)前研究的發(fā)現(xiàn)，其證明了H2S催化酶SQRDL I264T變體對前骨原MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化的顯著作用。

SQRDL基因的3'下游區(qū)域的rs11079467 SNP(單核苷酸多態(tài)性)最接近rs12594514 SNP，并且顯示與該SNP最強(qiáng)的相關(guān)性(距離：70bp和R2=0.983)。rs11079467 SNP在隊列試驗中顯示與骨質(zhì)疏松顯著相關(guān)，同時也證明肥胖和骨質(zhì)疏松的相關(guān)性[32]，這或許與脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞均來源于間充質(zhì)干細(xì)胞有關(guān)[33]?？傊?，SQRDL I264T nsSNP作為絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥的顯著易感性變異，密切參與骨形成的基礎(chǔ)機(jī)制，對前成骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化具有積極的影響。

4 外源性H2S對破骨細(xì)胞的影響

隨著對內(nèi)源性H2S在各種組織器官研究的不斷深入，外源性H2S調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝及功能的研究也不斷開展。內(nèi)源性H2S通過誘導(dǎo)CSE的表達(dá)增加谷胱甘肽的產(chǎn)生[9]，依賴NFE2生物因子的抗氧化反應(yīng)的激活[34]，調(diào)節(jié)氧化還原的平衡來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞。然而，H2S的外源性供體(NaHS)是否可以影響人類破骨細(xì)胞分化以及基礎(chǔ)配體的機(jī)制研究較少。

Laura等[35]發(fā)現(xiàn)NaHS通過劑量依賴性的降低h-OCs(人類破骨細(xì)胞)的分化，其機(jī)制主要是降低依賴RANKL(破骨細(xì)胞分化因子，可激活破骨細(xì)胞)的細(xì)胞ROS的水平和持續(xù)激活h-pre-OC中的NRF2(NFE2相關(guān)因子)抗氧化劑系統(tǒng)直接抑制h-OC的分化。此外，NaHS可以下調(diào)RANKL / OPG(護(hù)骨素)mRNA在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，抑制RANKL / OPG比例，間接的抑制h-OCs分化。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈支持NaHS直接和間接機(jī)制驅(qū)動調(diào)節(jié)h-OCs分化的能力，及在骨消耗性疾病的藥理學(xué)相關(guān)性。

5 小結(jié)

隨著我國人口老齡化日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥患者逐漸增多，其預(yù)防和治療成為醫(yī)療界的重大課題。研究結(jié)果表明H2S的生物合成涉及雌激素調(diào)節(jié)骨形成的機(jī)制，同時H2S水平下降參與小鼠OVX的骨消耗效應(yīng)。此外，H2S可抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)骨間質(zhì)細(xì)胞Ca2+通道、促進(jìn)MMP活性等預(yù)防治療骨質(zhì)疏松癥(見圖1)。H2S水平的恢復(fù)是絕經(jīng)后及長期使用Dext導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥潛在的新的治療方法。雖然H2S在骨代謝中起重要作用的精確機(jī)制有待檢查，但不可否認(rèn)，氣體信號分子H2S作為一個有潛力的新興領(lǐng)域在骨質(zhì)疏松的探索中有巨大的發(fā)展空間。H2S供體(例如NaHS)可以是現(xiàn)有藥物的有價值的替代物，其中大蒜油(證明是一種H2S供體)在OVX大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，可阻止骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[36]。其抑制了人破骨細(xì)胞(h-OC)分化的信號級聯(lián)中的氧化還原敏感性，抑制h-OC形成和功能，而不誘導(dǎo)其前體的凋亡或急性毒性。因此，可以保留殘余的h-OCs功能，這對于OB-OC之間的通信是非常重要的。更有趣的是，Towler等[37]研究發(fā)現(xiàn)指甲角蛋白中的二硫化物含量可以反映骨的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)含量，間接預(yù)測骨質(zhì)疏松癥和潛在性骨折。大量研究證據(jù)表明，H2S有著重要的臨床應(yīng)用價值，但是由于有限的實驗?zāi)Ｐ汀r間過程以及臨床應(yīng)用存在的不穩(wěn)定因素，仍有局限性。

圖1 機(jī)體H2S的生產(chǎn)酶途徑及對骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制Fig.1 The pathway of enzyme production of H2S and its effect mechanism on osteoporosis