王亞軍 浪萬英 宋亞文 張來舉 宋凱

1.甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院2014級碩士研究生,甘肅 蘭州 730000

近些年，我國患骨質(zhì)疏松癥的人數(shù)呈上升趨勢，且因其嚴重的癥狀引起醫(yī)學人士的關(guān)注[1-3]。為此，醫(yī)學專業(yè)人員不斷探索，尋求有效的防治方法。其探索范圍主要涉及西藥、中醫(yī)藥以及運動和飲食療法。其中中醫(yī)治療方法中，針灸顯示了其獨特的治療優(yōu)勢[4，5]。因此，醫(yī)學研究人員開始對針灸治療骨質(zhì)疏松癥的效果及其機理進行研究總結(jié)[6，7]。本文從基因水平研究了針刺血清對去卵巢大鼠骨形成和骨吸收活性的影響，為后續(xù)研究針刺治療骨質(zhì)疏松癥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

電針(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)；雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司 批號：199A3)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司 批號：SA1022)；大鼠OPG原位雜交檢測試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號：MK2149)；大鼠RANKL原位雜交檢測試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號：MK2100-r)；大鼠成骨細胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司 批號：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技術(shù)有限公司 批號：0111/A16)；通用細胞凍存液(北京雷根生物技術(shù)有限公司 批號：0111A16)；過氧化物酶阻斷液(博士德生物工程有限公司 批號：11C17B08)；DAB顯色試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司 批號：11B23C22)； 載玻片(中國制造批號：CAT.7101P)；顯微鏡蓋玻片(中國制造 批號：10212020C)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，0.35 mm×13 mm，0.5寸)。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的制備方法

選取SPF級2月齡SD雌性大鼠48只，隨機分為藥物組、針刺組、模型組和空白組，每組12只。將大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一橫指且旁開脊柱有一小的隆起處，剃去此處鼠毛，鋪無菌洞巾，以碘酊消毒。切開皮膚、背部肌肉、腹膜，以小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到粉色菜花樣卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，對皮，碘酊消毒，同法摘除另一側(cè)卵巢，造成骨質(zhì)疏松癥模型大鼠；空白組不切除[8]雙側(cè)卵巢。造模后飼養(yǎng)3個月，檢測骨密度和骨礦物含量。檢測結(jié)果顯示造模成功，見表1、表2。

組別nBMD(g/cm2)空白組120.172±0.003模型組120.157±0.012??

注：與空白組相比，**P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

組別nBMC(g/cm2)空白組1219.62±0.017模型組1218.54±0.058??

注：與空白組比較，**P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

1.2.2動物處理方法

空白組：不予任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

模型組：灌服與藥物組同體積的蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)。

藥物組：按照1 mL/100 g標準灌胃給予0．02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠給藥劑量按照人與大鼠體表面積比值折算而得)[9]，1次/1天，連續(xù)治療5天，間隔2天。20天1療程，治療3療程。

針刺組：“三陰交”穴位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝關(guān)節(jié)下側(cè)，腓骨小頭下緣5 mm處，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm；“腎俞”穴位于第2腰椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm。以大鼠腳趾中指和同身寸法確定旁開位置和針刺深度。剃去背部鼠毛，應(yīng)用針具及穴位常規(guī)消毒后，用30號0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針，頻率為2Hz，斷續(xù)波[10-12]，刺激強度1.0mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳，每次15 min。同時灌服與藥物組同體積的蒸餾水，1次/1天，連續(xù)治療5天，間隔2天。20天1療程，治療3療程。

1.2.3大鼠全身骨密度檢測

治療3個療程后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠。待至大鼠處于全身迷醉狀態(tài)下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠沒有甩尾動作，顯示達到最佳測定時段)，將其依次置于骨密度測定儀器。將大鼠置于測定板上，使四肢，尾部全部集中于測定板上，使頭部，軀體和尾部處于測定板的縱端中線上，避免偏移，并使全身處于伸展狀態(tài)。掃描全身，采用計算機顯示大鼠全身骨影像，保存掃描圖片，抄錄檢測數(shù)據(jù)[13-15]。

1.2.4大鼠成骨細胞的體外培養(yǎng)

將SD大鼠乳鼠(來自甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室)置于75%酒精中浸泡處死，無菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結(jié)締組織，PBS 清洗3次；將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37 ℃，每次10 min)，棄去上清液，0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化4 次(37 ℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150目濾網(wǎng)過濾3次，1 000 r /min離心10 min；棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10% PBS)，吹打均勻并計數(shù)。原代細胞懸液以3×104/mL接種于大皿(Nunc) 中培養(yǎng)，每皿10 mL，37 ℃、5%CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3 d換液1 次。待細胞鋪滿80%培養(yǎng)皿后進行爬片培養(yǎng)。

1.2.5成骨細胞的血清處理方法

采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各組大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血針對準心臟部位扎取一定量血液，冷置1 h，離心(2 500 r/min，25 min)，棄去沉淀物，保留上層血清。將上層血清采用56 ℃水浴滅活30 min，并用0.22 μm的濾網(wǎng)抽濾除菌。將各組制備血清依10%的比例加入爬片培養(yǎng)的成骨細胞3天后，4%多聚甲醛固定10 min。采用原位雜交法處理各組細胞爬片，并通過圖像分析處理軟件IPP選取恰當視野，提取灰度值，結(jié)果采用積分光密度(IOD)表示。

1.2.6原位雜交方法

(1)OPG mRNA的檢測

運用針對Osteoproteogrin(OPG)的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標記，采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術(shù)，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法。針對大鼠OPG靶基因的mRNA序列為：

(1)5’——TGGAC AACCC AGGAA ACCTT TCCTC CAAAA——3’

(2)5’——TTTGC CTGGG ACCAA AGTGA ATGCA GAGAG——3’

(3)5’——AGAAA TGATA GGGAA TCAGG TTCAA TCAGT——3’

將成骨細胞爬片采用4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室溫固定20-30分鐘，蒸餾水充分洗滌，干燥后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

30%H2O21份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘，蒸餾水洗滌2次。

暴露mRNA核酸片段：爬片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1 mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，室溫消化5-120秒。PBS洗3次×5分鐘，蒸餾水洗1次。

后固定：4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室溫固定10分鐘，蒸餾水洗滌3次。

預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度，每張爬片20 μL加預雜交液，恒溫箱38 ℃-42 ℃，2-4小時，吸取多余液體，不洗。

雜交：按每張爬片20 μL雜交液，加在爬片上，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在爬片上，恒溫箱38 ℃-42 ℃雜交過夜。

雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37 ℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次。

滴加封閉液：37℃30分鐘，甩去多余液體，不洗。

滴加生物素化鼠抗地高辛：室溫120分鐘，PBS洗5分鐘×4次。

滴加SABC:室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次。

滴加生物素化過氧化物酶：室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×4次。

使用DAB顯色后流水清洗，乙醇梯度脫水，樹脂封片，拍照采集照片。

(2)RANKL mRNA的檢測

運用針對RANKL的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標記，采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術(shù)，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法。針對大鼠RANKL靶基因的mRNA序列為：

(1)5’——TACTT TCGAG CGCAG ATGGA TCCTA ACAGA ATATC——3’

(2)5’——TTGGT ACCAT GATCG AGGCT GGGCC AAGAT CTCTA——3’

(3)5’——GATCC GGATC AAGAT GCGAC GTACT TTGGG GCTTT——3’

檢測步驟同上。

1.2.7統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠全身骨密度BMD檢測結(jié)果

如表3所示，與空白組相比，模型組全身BMD顯著降低(P<0.01)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，BMD顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

組別nBMD(g/cm2)空白組120.179±0.001??模型組120.156±0.005藥物組120.169±0.034??針刺組120.170±0.001??

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.2 大鼠全身骨礦物含量BMC檢測結(jié)果

如表4所示，與空白組相比，模型組全身BMC顯著降低(P<0.01)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，BMC顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

組別nBMC(g/cm2)空白組1222.213±0.016??模型組1218.550±1.086藥物組1220.038±2.105??針刺組1220.213±1.267??

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.3 大鼠血清處理后成骨細胞OPG mRNA表達結(jié)果

如圖1所示，其中空白組OPG mRNA表達量最高，模型組最低，經(jīng)過藥物或針刺處理后，OPG mRNA表達顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 各組成骨細胞OPG mRNA表達情況注：與模型組相比，**P<0.01，具有統(tǒng)計學意義。Fig.1 OPG mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group, **P<0.01，statistically significant.

2.4 大鼠血清處理后成骨細胞RANKL mRNA表達結(jié)果

如圖2所示，其中空白組RANKL mRNA表達量最低，模型組最高，經(jīng)過藥物或針刺處理后，RANKL mRNA表達顯著下降，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 各組成骨細胞RANKL mRNA表達情況注：與模型組相比,**P<0.01，具有統(tǒng)計學意義。Fig.2 RANKL mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group,**P<0.01，statistically significant.

3 討論

筆者在查閱有關(guān)針灸治療骨質(zhì)疏松癥的研究[16-18]中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究集中在探究針刺對骨質(zhì)疏松癥大鼠生化、骨密度、生物力學、蛋白和基因等方面，其研究結(jié)果亦證實針灸確實能明顯改善患者的臨床骨質(zhì)癥狀。在此基礎(chǔ)上，本課題結(jié)合了“針灸血清學”研究方法并進一步探索。實驗研究結(jié)果表明，藥物和針刺對去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠均能取得療效。從成骨細胞骨重建方面來講，針刺血清能從基因水平影響成骨細胞OPG，RANKL的表達，從而調(diào)節(jié)骨重建和骨破壞環(huán)節(jié)的平衡。因此，該實驗結(jié)果為臨床上針灸治療多種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥提供理論支持。

中醫(yī)學理論認為，腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。因此本研究依據(jù)實驗動物針灸學選取了最具調(diào)節(jié)肝脾腎三臟功能的穴位，同時設(shè)立陽性藥物組與之形成對比。探究結(jié)果進一步深化了以往研究結(jié)果，給針灸治療骨質(zhì)疏松癥的理論研究再添新象，亦能更好地支持臨床采用針灸推拿治療骨質(zhì)疏松癥。與此同時，希望該領(lǐng)域研究人員能更深入探索運用針灸骨質(zhì)疏松癥的實質(zhì)性內(nèi)容[19-21]。