王正想 張國強 高順強 劉思源

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·論著·

轉(zhuǎn)染c-kit基因?qū)375細胞增殖和凋亡的影響

王正想1張國強2高順強2劉思源3

目的： 明確轉(zhuǎn)染c-kit基因?qū)375細胞增殖、凋亡的影響。方法： 體外培養(yǎng)人惡性黑素瘤A375細胞，分為A組(實驗組)、B組(轉(zhuǎn)染空病毒載體的陰性對照組)、C組(空白對照組)。轉(zhuǎn)染后采用RT-PCR檢測c-kit mRNA表達情況，在倒置相差顯微鏡觀察A375細胞分化及形態(tài)，MTT比色分析法檢測對A375細胞增殖抑制的影響，流式細胞分析術(shù)，Anexin-v-PI雙染色檢測細胞早期凋亡的變化。結(jié)果： 轉(zhuǎn)染后A組細胞出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂，漂浮細胞增多。RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，A組擴增出c-kit cDNA 230 bp大小片段，而B、C組則沒有擴增出相應(yīng)大小的片段。轉(zhuǎn)染后A組OD值低于B、C組(P<0.05)，A組早期凋亡率高于B、C組有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論： 轉(zhuǎn)染c-kit后A375細胞增殖被抑制，早期凋亡增加。

黑素瘤； 轉(zhuǎn)移性； A375細胞； 早期凋亡

近年來惡性黑素瘤(malignant melanoma, MM)發(fā)病率有明顯上升趨勢，其發(fā)病率正以每年4.1%的速度顯著上升，快于任何其他惡性腫瘤[1]。早期黑素瘤患者預(yù)后較好，治療以手術(shù)為主；晚期黑素瘤的治療一直沒有突破，轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤患者中位生存期僅為6～9個月，5年生存率不足5%。惡性黑素瘤的免疫及基因治療方法，受到廣泛關(guān)注。促分裂原活化蛋白激酶通路(MAPK通路)是與黑素瘤發(fā)病密切相關(guān)的分子相關(guān)通路之一，c-kit可以激活MAPK通路,P13K-AKT通路和Janus激酶傳感信號以及STAT轉(zhuǎn)錄，維持正常黑素細胞的穩(wěn)定。c-kit與NRAS突變主要與軀干型黑素瘤和黏膜型黑素瘤相關(guān)[2]。c-kit過表達與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的機制仍有待進一步研究。本研究利用腺病毒相關(guān)載體建立穩(wěn)定表達c-kit的惡性黑素瘤細胞A375細胞株，觀察其對腫瘤細胞生物活性的影響，探索有效針對侵襲性、惡性黑素瘤的靶向治療提供方向，為惡性黑素瘤的臨床治療提供一個新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞與材料 人黑素瘤細胞株A375由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、DMEM(高糖型)培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司，腺病毒相關(guān)載體及c-kit腺病毒復(fù)合體(綠色熒光蛋白做標記)由武漢晶賽生物公司合成，CO2恒溫培養(yǎng)箱(TC2323)購自美國Sheldon公司，RT-PCR酶混合物試劑盒(美國Fermentas公司)、二甲基亞楓(DMSO)購自北京化工廠。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 A375細胞常規(guī)復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含濃度為100 u/mL青霉素、鏈霉素，pH 7.2～7.4)，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，3次傳代穩(wěn)定后用于實驗。將細胞分為A、B、C 組。

1.3 c-kit基因轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)4～6 h待細胞完全貼壁，小心吸出各孔培養(yǎng)液。各組均加入不含牛血清的培養(yǎng)基100 μL，A、B組分別加入DMEM培養(yǎng)基/c-kit病毒載體復(fù)合體、DMEM培養(yǎng)基/病毒載體，C組應(yīng)加入不含病毒載體的DMEM培養(yǎng)基，余處理過程與A，B相似，轉(zhuǎn)染時間為90 min，每15 min輕輕晃動培養(yǎng)液一次，以混勻。90 min后移除含病毒的無血清培養(yǎng)液，加入含血清的常規(guī)培養(yǎng)液，放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)1、3、5、7 d時熒光顯微鏡下觀察細胞分化及形態(tài)學(xué)變化，計算轉(zhuǎn)染效率(熒光顯微鏡下細胞個數(shù)/光學(xué)微鏡下細胞個數(shù))，消化回收細胞備用。以cDNA作為模板，培養(yǎng)48 h后通過G418進行抗性篩選陽性克隆，采用有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達c-kit的A375細胞,采用Real-time PCR檢測3組細胞株c-kit mRNA的表達，按TRIzol試劑盒說明書步驟抽提A、B組和C組細胞的總RNA并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以cDNA作為模板，通過RT-PCR生成mRNA，RT-PCR引物設(shè)計:c-kit的上游序列 5-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3，下游序列 5-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3，β-actin的上游引物是:5′-CTGGCACCACCCTTCTACAAT-3′;下游引物是:5′-AATGTCACGCCGATTTCCCGC-3′;c-kit、β-actin的擴增片斷長度分別為232 bp和155 bp[3]，引物由上海捷瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司負責(zé)合成和PAGE純化，用無菌去離子水稀釋。瓊脂糖凝膠電泳:分別取5 μL RT-PCR產(chǎn)物、Marker，在1.5%的瓊脂糖凝膠中，恒壓80 V電泳30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，進行分析。

1.4 MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染c-kit后A375細胞的增殖影響情況 取對數(shù)生長期的A375細胞，制備單細胞懸液，進行細胞計數(shù)調(diào)整至1×104個細胞/200 μL，分別接種到5個不同的96孔板中，每組接種6個復(fù)孔細胞培養(yǎng)過夜，按上述分組及轉(zhuǎn)染步驟進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后蓋好蓋子，周邊貼膠布，在其上標明日期。放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7天相同時相點時前4 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37℃、5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，避光條件下震蕩10～15 min，用全自動酶標儀于波長492 nm處測定各孔光吸收值，所有試驗重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.5 Annexin V與PI雙染，流式檢測轉(zhuǎn)染后不同時相的早期凋亡情況 (1)取生長狀態(tài)良好的瓶裝細胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為1×106/瓶，分到60個不同個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)過夜后，隨機分為A組、B組、C組，各組又隨機分為1 d，3 d，5 d，7 d組，并做標記，1 d，3 d，5 d，7 d各組5個標本，分組后按上述轉(zhuǎn)染步驟進行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)放入37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)一天后，取1 d組培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入2 mL的0.25%胰蛋白酶消化，置于倒置顯微鏡下觀察，見細胞間連接消失，細胞胞質(zhì)回縮，倒掉胰酶，再加入剛才收集的舊培養(yǎng)基終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁細胞，以確保所有貼壁細胞都能被吹打下來，但吹打時動作要輕柔，同時盡可能不出現(xiàn)泡沫，細胞脫壁后形成細胞懸液。將細胞懸液吸入相應(yīng)離心管中，離心，1000 g，5 min。離心完畢后去上清液,緩慢1 mL冷PBS溶液，輕輕震蕩使細胞懸浮，離心，1000 g，5 min，再用PBS洗滌細胞兩次。(3)用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/mL。(4)取100 μL 的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC，于室溫下孵育避光15 min，加入10 μL的碘化柄錠溶液。(5)混勻后于室溫下避光孵育15 min。(6)在反應(yīng)管中加400 μL PBS，流式細胞儀(FACS)分析。(7)結(jié)果分析APOI(凋亡細胞數(shù)/細胞計數(shù)總數(shù))表示細胞凋亡情況。(8)細胞培養(yǎng)3、5、7 d重復(fù)以上操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)全部以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察各組人黑素瘤細胞A375形態(tài) B、C組細胞生長狀態(tài)良好，數(shù)目多，貼壁能力強，細胞形態(tài)呈多角形或梭形，有偽足長出，細胞胞膜光滑完整，有光澤，胞漿均勻、飽滿，折光性良好，可與周圍細胞融合，呈片狀，形成單細胞層(圖1)。A組細胞貼壁能力差，細胞生長狀態(tài)緩慢，出現(xiàn)少數(shù)圓形細胞，部分細胞皺縮，甚至破裂，失去原有的折光性，隨著時間延長，懸浮細胞增多，貼壁細胞數(shù)量較B、C組減少(圖1)，且隨時間延長，差別越明顯。

2.2 RT-PCR檢測各組A375細胞c-kit mRNA表達 A組擴增出c-kit mRNA 230 bp大小片段，RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，實驗組人黑素瘤A375細胞c-kit mRNA校正值為0.149±0.042，而未轉(zhuǎn)染的A375細胞則沒有擴增出相應(yīng)大小的片段較對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明在RNA水平檢測到外源性c-kit基因的轉(zhuǎn)錄。

2.3 轉(zhuǎn)染c-kit基因?qū)θ藧盒院谒亓黾毎鸄375增殖抑制的影響 轉(zhuǎn)染c-kit基因后應(yīng)用MTT法檢測細胞生長抑制情況，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后1、3、5、7 d， A組吸光光度值低于B、C組,A組與B、C組有顯著性差異(P<0.05),而B組與C組之間無顯著性差異(P>0.05)。見表1，圖2。

表1 各組轉(zhuǎn)染后不同時間OD值比較±s)

注:A組與B、C組相比,均P<0.05

圖1 倒置相差顯微鏡觀察各組人黑素瘤細胞A375形態(tài)

圖2 熒光顯微鏡觀察各組人黑色素瘤細胞A375形態(tài)

圖3 RT-PCR檢測各組A375細胞c-kit mRNA表達

2.4 轉(zhuǎn)染c-kit基因后對人惡性黑素瘤細胞A375早期凋亡的影響 Annexin V-PI雙染色流式細胞儀分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c-kit基因后1、3、5、7 d， A組凋亡率吸光光度值高于B、C組,A組與C組、B組有顯著性差異(P<0.05),而C組與B組之間無顯著性差異

(P>0.05)，見圖4、表2。

表2 各組轉(zhuǎn)染后不同時間凋亡率比較±s)

注:A組與B、C組相比,均P<0.05

圖4 轉(zhuǎn)染c-kit基因后對人惡性黑素瘤細胞A375早期凋亡的影響

3 討論

惡性黑素瘤(MM)是一種高度惡性腫瘤，可發(fā)生與多種組織器官，其中皮膚惡性黑素瘤發(fā)病率高，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，一經(jīng)確診首選完整切除原發(fā)灶，對于IV期有遠處轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)治療不能明顯提高生存率，隨著人們對惡性黑素瘤分子生物學(xué)異常的逐步認識，分子靶向治療惡性黑素瘤成為腫瘤治療中的熱點，一些分子靶向治療的藥物也相繼進入臨床試驗階段，分子靶向藥物和化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的療效，彌補了化療藥物療效的不足，從一定程度上提高了治療效果，開辟了惡性黑素瘤的新的治療途徑，是該病治療的新的發(fā)展方向。

C-kit 基因是一種原癌基因，定位于染色體4q11-12上，最早于1986年在HZ4貓肉瘤病毒內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其表達的蛋白產(chǎn)物為c-kit受體又稱干細胞因子受體，被命名為CD117[4]，干細胞因子與c-kit 受體結(jié)合形成受體二聚體復(fù)合物，誘導(dǎo)下游細胞內(nèi)分子磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、黏附和細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)c-kit在良性色素痣中的表達呈強陽性，而在轉(zhuǎn)移性黑素瘤的細胞中c-kit的表達逐漸減弱甚至缺失[5-7]。在體外培養(yǎng)的各類黑素瘤細胞中均不表達c-kit，人惡性黑素瘤細胞A375具有較強的增殖和轉(zhuǎn)移能力，惡性度高，且在體外培養(yǎng)條件下無c-kit的表達，這一點也得到了證實了。在本研究中用病毒載體轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤A375細胞，在熒光顯微鏡下計算出轉(zhuǎn)染效率，獲得多株c-kit陽性細胞，用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)陽性克隆細胞株c-kit表達明顯增加，進一步證實通過病毒載體成功導(dǎo)入A375細胞，從而構(gòu)建成穩(wěn)定表達c-kit的人惡性黑素瘤A375細胞株。通過轉(zhuǎn)染后的A375細胞c-kit的表達明顯增加，且該細胞的的生物學(xué)行為也發(fā)生改變，A375細胞增殖被抑制，早期凋亡增加。c-kit受體來發(fā)揮其生物學(xué)功能可能的機制：c-kit 受體與干細胞因子結(jié)合后形成受體二聚體復(fù)合物,誘導(dǎo)下游細胞分子發(fā)生磷酸化改變,激活下游的信號傳導(dǎo)通路(如MAPK通路,P13K-AKT通路和Janus激酶傳感信號以及STAT轉(zhuǎn)錄等),從而精細的調(diào)節(jié)A375細胞的基因表達、增殖和分化等生物學(xué)行為；干細胞因子(SCF)需要與受體即c-kit 結(jié)合才能發(fā)揮其調(diào)控作用；另外c-kit蛋白的過度表達與c-kit基因的突變緊密相關(guān)[8-10]，c-kit基因突變(點突變,錯義突變,缺失突變和插入突變等)，引發(fā)下游信號通路傳導(dǎo)異常，腫瘤細胞異常增殖而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。伊馬替尼是針對c-kit突變的小分子靶向藥物，競爭性抑制三磷酸腺苷與胸苷激酶受體c-kit的結(jié)合位點，酪氨酸激酶(TK)磷酸化受阻，從而抑制信號傳導(dǎo)，并可抑制與激酶活性相關(guān)的c-kit突變(引起c-kit受體活化)。Guo等[11]報道KIT基因突變的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者應(yīng)用伊馬替尼的II期臨床試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼有效，并且能延長患者無病生存期。

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(收稿：2017-01-09 修回：2017-02-20)

The effect of c-kit on A375 cell proliferation and apoptosis

WANGZhengxiang1,ZHANGGuoqiang2,GAOShunqiang2,LIUSiyuan3.

1InstituteofDermatology,TheCenterHospitalofCangzhou061000,Hebei,China; 2InstituteofDermatology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity, 050011,Shijiazhuang,China; 3DepartmentofOncologyinBoneandSoftTissueDepartment,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity050051,Shijiazhuang,China

Correspondingauthor:LIUSiyuan,E-mail: 306734712@qq.com

Objective: To determine the effect of c-kit gene on the proliferation and apoptosis of A375 cells. Methods: Human malignant melanoma A375 cells were cultured and divided into the group A (adenovirous vector group), group B (vacant adenovirous vector group) and group C (blank control group). The expression level of c-kit mRNA was detected by RT-PCR. The differentiation and morphology of the cells were observed under the inverted microscope. The proliferation ability and apoptosis of A375 cells were detected by MTT and Annexin V-FITC/PI. Results: There was more shrinking and splinter cells in group A than those in group B and C. The c-kit cDNA 230bp was detected in group A but not in group B and C. The proliferation ability of A375 cells in group A was lower than those in group B and C, with a significant difference (P<0.005). The apoptosis rate of A375 cells in the group A was higher than that in the group B and C (P<0.05). Conclusion: The proliferation ability of A375 cells is inhibited and apoptosis is induced after transfected by c-kit gene.

malignant melanoma; metastasis; A375 cells; apoptosis

國家自然基金主任基金(編號：30440086)

1河北滄州市中心醫(yī)院皮膚科，滄州，061001 2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，石家莊,050010 3河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，石家莊,050010

劉思源，E-mail：306734712@qq.com