莊 樂 馬偉元

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·論著·

miR-203及其下游靶基因p63和survivin在瘢痕疙瘩皮損中的表達

莊 樂 馬偉元

目的： 檢測瘢痕疙瘩皮損中miR-203及其下游靶基因p63和survivin mRNA的表達。方法： Real-time PCR法檢測30例瘢痕疙瘩皮損及30例健康對照皮膚中miR-203、p63和survivin mRNA的表達。結果： 與健康對照皮膚相比，瘢痕疙瘩皮損中miR-203表達明顯下調，其表達量為對照組的0.32±0.16倍(P<0.05)，靶基因p63和survivin mRNA表達明顯上調，其表達量分別為對照組的3.90±0.84倍和5.11±0.93倍(均P<0.05)。經Pearson相關性分析，miR-203與survivin間呈負相關(r=-0.40，P<0.05)，miR-203與p63間呈負相關(r=-0.51,P<0.05)。結論： miR-203及其下游靶基因p63和survivin可能參與了瘢痕疙瘩的發(fā)病過程。

miR-203； p63； survivin； 瘢痕疙瘩

瘢痕疙瘩是人類皮膚受損、創(chuàng)面愈合后局部組織過度纖維化的結果，成纖維細胞的大量增生和膠原的過度沉積是瘢痕疙瘩的組織病理學改變[1]。以往的研究證實，p63和凋亡抑制基因(survivin)在瘢痕疙瘩皮損中高表達[2,3]，且參與成纖維細胞異常增殖和膠原蛋白分泌等病理過程，但其具體的調控機制不清。基因表達受到多個層面和多條途徑的調控，目前microRNA調控基因表達和表觀遺傳學研究成為了熱點問題。其中miR-203參與皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能維持，是皮膚中重要的調控因子[4]。目前研究證實，miR-203為survivin和p63上游重要的調控基因[5,6]。本研究擬通過real-time PCR技術檢測瘢痕疙瘩皮損中miR-203、survivin和p63 mRNA的表達情況，統(tǒng)計分析其表達水平的相關性，從mircoRNA角度解釋瘢痕疙瘩皮損中p63和survivin基因表達上調的原因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月至2014年7月，我科病理室保存的瘢痕疙瘩患者蠟塊標本30例。其中男性15例，女性15例，年齡19～46歲，平均37.6歲。 另選取30例健康皮膚為對照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑 石蠟組織總RNA提取試劑盒、石蠟組織microRNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術公司，一步法反轉錄試劑盒、SYBR Green I實時定量PCR kit購于瑞士羅氏公司，DEPC及RNase free水購于北京索萊寶生物技術公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為分析純，購于國藥集團上海試劑公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA和microRNA的提取 將蠟塊標本整修去除組織周圍盡量多的石蠟，10 μM厚連續(xù)切片，取4張切片裝入一個無RNase的Ep管中，二甲苯脫蠟，無水乙醇徹底洗滌并晾干,后續(xù)提取步驟嚴格按照microRNA和總RNA提取試劑盒的說明書進行。微量紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度。

1.3.2 Real-time PCR檢測miR-203、survivin及p63的表達 MA Weiyuan采用一步法反轉錄試劑盒合成cDNA，microRNA的反轉錄采用加尾法。SYBR green I染料法進行Real-time PCR反應，miR-203以U6作為內參照，引物購自廣州復能基因有限公司，survivin和p63以GAPDH作為內參照。survivin、p63及GAPDH引物均由 Primer Premier 6.0 軟件設計，BLAST驗證引物特異性，上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體引物序列為：survivin上游5ˊ-GACCACCGCATCTCTACATTC-3ˊ，下游5ˊ-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3ˊ，p63上游5ˊ-GAAACCAGAGATGGGCAAGTC-3ˊ下游5ˊ-GCTTCGTACCATCACCGTTCT-3ˊ，GAPDH上游5ˊ-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3ˊ，下游5ˊ-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3ˊ。每個樣本設3個復孔，反應條件為：95℃預熱3 min；95℃12 s，60℃ 40 s，40個循環(huán)?！鰿t值=目的基因的Ct值-同組內參的Ct值，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，2-△△Ct值即為實驗組目的基因較對照組目的基因表達的倍數。

2 結果

2.1 miR-203、survivin、p63在瘢痕疙瘩皮損中的表達 采用real-time PCR技術檢測30例瘢痕疙瘩皮損與30例健康對照皮膚組織中miR-203、survivin、p63的表達水平。通過熒光定量 PCR 擴增曲線，產物到達平臺期，對融解曲線分析，可以看到單一的峰型，說明擴增產物有較高的特異性。PCR 產物采用比較Ct法定量，根據 2- △△Ct值計算基因的起始模板量，從而反映出在不同樣本的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩皮損中miR-203的表達較健康對照皮膚明顯下調，其表達量為對照組的0.32±0.16倍(t=22.73，P<0.05)，survivin和p63在瘢痕疙瘩皮損中的表達較健康對照皮膚明顯上調，其表達量分別為對照組的5.11±0.93倍(t=24.87，P<0.05)，3.90±0.84倍(t=17.11，P<0.05)。結果如圖1～3所示。

圖1 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對照組皮膚組織中miR-203 mRNA的相對表達量，瘢痕疙瘩皮損中miR-203的表達顯著下調(*P<0.05) 圖2 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對照組皮膚組織中survivin mRNA的相對表達量，瘢痕疙瘩皮損中survivin的表達顯著上調(*P<0.05) 圖3 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對照組皮膚組織中p63 mRNA的相對表達量，瘢痕疙瘩皮損中p63的表達顯著上調(*P<0.05)

2.2 瘢痕疙瘩皮損中miR-203與sruvivin、p63表達的相關性經Pearson相關性分析，miR-203與survivin兩者之間呈負相關(r=-0.40，P<0.05)，miR-203與p63兩者之間呈負相關(r=-0.51,P<0.05)。

3 討論

成纖維細胞在瘢痕疙瘩的形成、發(fā)展和轉歸過程中處于中心地位，而成纖維細胞中膠原蛋白合成異常導致的細胞外基質代謝異常是瘢痕疙瘩發(fā)病的重要因素[7，8]。國內外研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常真皮成纖維細胞在形態(tài)學上并沒有明顯差異，但在功能上卻明顯不同。與正常成纖維細胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細胞合成膠原蛋白的能力明顯提高[9]。成纖維細胞增殖、凋亡及分化的異常，是多個層面、多條途徑、多種方式調控異常導致的病理表現(xiàn)。目前研究普遍認為，瘢痕疙瘩中存在過度表達的細胞轉化生長因子β(TGF-β)，過度表達的TGF-β通過各種信號轉導通路最終導致了膠原蛋白的過度合成和分泌。除合成過度外，瘢痕疙瘩組織中還存在膠原蛋白降解的異常，最終致使膠原蛋白合成大于分解，過度的膠原蛋白沉積引發(fā)了瘢痕疙瘩皮損的形成[9]。miR-203是一種具有高度皮膚特異性的microRNA，在皮膚發(fā)育中起著調控細胞增殖和分化的開關作用[4]。miR-203 在增殖細胞中高表達，能夠抑制細胞增殖、誘導并促進細胞分化[10]。本研究結果證實，瘢痕疙瘩皮損中miR-203表達水平較健康對照皮膚明顯下調。由此推測，低表達的miR-203可能參與瘢痕疙瘩成纖維細胞異常增殖和膠原蛋白過度分泌的病理過程。

目前生物信息學研究證明，survivin和p63都是miR-203進化保守的靶基因之一。survivin主要在細胞周期G2/M期表達,定位于細胞有絲分裂的紡錘體,具有促進細胞有絲分裂的作用。此外，survivin還可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達，抑制細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩皮損中survivin mRNA的表達水平較健康對照皮膚組織明顯上調，這與國內外的研究結果均一致[2]。survivin作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成員[12]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子之一，和瘢痕疙瘩的形成有密切關系。survivin的高表達與瘢痕疙瘩成纖維細胞的異常增殖和分化有關，同時也參與瘢痕組織中毛細血管的新生過程[13]。p63基因是腫瘤抑制基因p53家族成員之一，其在細胞死亡、分化、腫瘤發(fā)生中扮演重要角色[14]，控制著成纖維細胞的增殖和分化。本研究結果發(fā)現(xiàn)，p63 mRNA在瘢痕疙瘩皮損中表達上調，這與國外的研究結果一致[3]。高表達的p63基因能夠通過特異性的結合到啟動子區(qū)域，阻斷腫瘤抑制基因p53的功能[15，16]，從而在瘢痕疙瘩中發(fā)揮重要作用。經統(tǒng)計分析，miR-203 mRNA的表達水平與survivin mRNA的表達水平呈負相關，與p63 mRNA的表達水平呈負相關。由此推測，miR-203的異常表達可能導致survivin和p63基因表達上調，進而促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、抑制其凋亡，參與了皮損的形成過程。

綜上所述，miR-203可能通過調控其下游靶基因survivin、p63的異常表達參與瘢痕疙瘩皮損的形成過程。

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(收稿：2017-01-10 修回：2017-02-22)

Expression of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the keloid lesions

ZHUANGLe,MAWeiyuan.

Departmentofdermatology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.

Correspondingauthor:MAWeiyuan,E-mail:dermatologyqlh@163.com

Objective: To detect the RNA expression levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the lesions of keloid. Methods: The RNA levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin from 30 lesions and 30 normal controls were detected by the quantitative real-time PCR technique. Results: The expression level of miR-203 in the lesions of keloid was dramatically down-regulated which was 0.32±0.16 of the normal controls (P<0.05). While the expression levels of p63 and survivin in the lesions of keloid were sharply up-regulated which were 3.90±0.84 times and 5.11±0.93 times than those in the normal controls respectively (P<0.05). Conclusion: miR-203 and its downstream targets p63 and survivin are probably involved in the pathogenesis of keloid.

miR-203; p63; survivin; keloid

山東省自然科學基金資助(編號：ZR2014MP007)

山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科，濟南，250012

馬偉元，E-mail：dermatologyqlh@163.com