肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳

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銀杏葉提取物EGb761對氧化應(yīng)激下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞抗氧化作用的影響

肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳

目的： 明確銀杏葉提取物(EGb761)對氧化應(yīng)激下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞抗氧化作用的影響。方法： 人正常黑素細(xì)胞系PIG1予以H2O2處理建立氧化應(yīng)激模型，予以不同濃度(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL)EGb761處理，采用MTT法檢測PIG1細(xì)胞活力，生物化學(xué)方法檢測脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH),谷胱甘肽過氧化物酶活性及含量，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果： 與模型組比較，EGb761組PIG1細(xì)胞活力、SOD、GSH-Px水平增高，ROS、MDA及LDH的表達(dá)水平降低。結(jié)論： 銀杏葉提取物EGb761可保護(hù)黑素細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷。

銀杏葉提取物； 白癜風(fēng)； 氧化應(yīng)激

銀杏樹在我國分布非常廣泛，銀杏葉及銀杏果都具有良好的藥用價值，早在元代吳瑞著的《日用本草》中其藥用價值就有所記載。銀杏可以補(bǔ)氣養(yǎng)血，健脾益腎。自上世紀(jì)六十年代起，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo bilobaleaves，EGb761)具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以防治氧化應(yīng)激引起的多種心腦血管疾病[1]。銀杏葉提取物中最主要的活性成分為銀杏總黃酮和銀杏內(nèi)酯，具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等多種作用，它可以減輕氧化應(yīng)激所致神經(jīng)元損傷，促進(jìn)受損神經(jīng)功能恢復(fù)[2]，臨床應(yīng)用于皮膚、心血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病的治療[3]。本研究擬采用銀杏葉提取物作用于H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷，以觀察銀杏葉提取物對白癜風(fēng)氧化應(yīng)激的防治作用，從而為臨床白癜風(fēng)的中藥防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞，254培養(yǎng)基及人黑素細(xì)胞生長添加劑(美國Cascade Biologics/Invitrogen公司)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，EGb761(德國Schwabe公司專利/臺灣濟(jì)生公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 (北京索萊寶科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)，4,5-dimethylthiazol-2-基-2,5- diphe-nyltetrazolium溴化物(MTT)購自Sigma公司(密蘇里州，美國)。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(南京，中國)。超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞培養(yǎng)及EGb761最佳作用濃度及時間的篩選 取正常人黑素細(xì)胞系PIG1培養(yǎng)，采用含5%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素及100 mg/mL鏈霉素的254培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。PIG1增殖至60%融合時加入0.5 mmol/L H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激模型組，分別于H2O2處理24 h后加入50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL的EGb761處理0、12、24、48 h。采用MTT法檢測黑素細(xì)胞的細(xì)胞活力變化。

1.2.2 MTT法檢測黑素細(xì)胞的活力 實驗分為三組，即空白組(未做任何處理)、模型組(0.5 mmol/L H2O2處理PIG1)及EGb761處理組(0.5 mmol/L H2O2處理24 h后加入100 μg/mL EGb761處理48 h)。各組細(xì)胞于96孔板培養(yǎng)，待檢測時每孔加入MTT檢測液 20 μL，將其置于37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)4 h；然后再加入DMSO 150 μL并將其置于搖床上10 min，用波長為570 nm的酶標(biāo)儀測定黑素細(xì)胞活力的變化。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測定 細(xì)胞處理同理同上，待檢測時收集細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，置于37 ℃中作用45 min，然后于流式細(xì)胞儀488 nm處檢測細(xì)胞內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度(%)。

1.2.4 酶學(xué)、生物化學(xué)方法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物檢測 細(xì)胞處理同理同上，按照試劑盒說明檢測各組細(xì)胞中丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性及含量，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)比較分析，定性資料采用Wilcoxon秩和檢驗或者卡方檢驗。定量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法，方差不齊時選用Satterthwaite方法進(jìn)行校正的t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗。實驗結(jié)果以P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGb761對氧化應(yīng)激下PIG1細(xì)胞活力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，加入不同濃度的EGb761后，黑素細(xì)胞的活力可以不同程度的升高，且隨著時間的延長細(xì)胞活力增加，我們研究發(fā)現(xiàn)100 μg/mL的EGb761處理PIG1 48 h時，細(xì)胞活力最高(圖1)，因此我們后續(xù)試驗選用100 μg/mL為EGb761的最佳作用濃度，并選定處理48 h為作用時間進(jìn)行研究。

圖1 EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞活力的影響(n=10)

2.2 EGb761對氧化應(yīng)激下PIG1細(xì)胞抗氧化能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，100 μg/mL EGb761可以顯著增加H2O2處理下PIG1細(xì)胞的活力(圖2a)，并且加入EGb761后LDH的釋放由13.5%降低到9.4%，顯著降低H2O2處理誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶(LDH)的釋放(圖2b)；并且EGb761可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖3a)；對脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量檢測，發(fā)現(xiàn)空白組為(8.8±0.5)μmol/mg蛋白，加入H2O2后上升為(22.3±1.5)μmol/mg蛋白，而加入EGb761處理后降低至(17.8±0.7)μmol/mg蛋白(圖3)；接下來，我們檢測了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，發(fā)現(xiàn)H2O2處理黑素細(xì)胞后，SOD活性由(2.87±0.26)Unit/mg蛋白下調(diào)至(1.38±0.2)Unit/mg蛋白，而EGb761處理后可回升至(2.74±0.34)Unit/mg蛋白(圖4a)；同樣加入EGb761后GSH-Px的活性由模型組的(16.9±0.9)Unit/mg蛋白上升至(24.2±1.8)Unit/mg蛋白(圖4b)，表明EGb761可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞SOD及GSH-Px活性增強(qiáng)。綜合以上結(jié)果，表明EGb761可以不同程度的改善黑素細(xì)胞的氧化損傷修復(fù)，對黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

圖2 a：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞活力影響(n=10，##P<0.01 vs空白組；**P<0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞LDH釋放的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P< 0.01 vs模型組)

圖3 a：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS(n=10，##P< 0.051 vs 空白組；**P< 0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞MDA生成的影響(n=10，##P< 0.051 vs 空白組；**P< 0.01 vs 模型組)

圖4 a：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞抗氧化酶SOD活性的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P<0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞GSH-Px活性的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P<0.01 vs 模型組)

3 討論

白癜風(fēng)是一種由于色素脫失所致的皮膚病?！吨T病源候論》中記載：“面及頸身體皮肉色變白，與肉色不同，亦不癢痛，謂之白癜”。白癜風(fēng)雖易于診斷卻難于治療，影響容貌，給患者帶來極大的心理影響和生活壓力。本研究期望對白癜風(fēng)的預(yù)防、治療與調(diào)養(yǎng)起到指導(dǎo)作用提供實驗依據(jù)。

黑素細(xì)胞起源于外胚層的神經(jīng)嵴, 在胚胎發(fā)育過程中通過間充質(zhì)逐漸移行到表皮、毛囊、眼等處。黑素細(xì)胞的發(fā)育大致經(jīng)歷了神經(jīng)嵴細(xì)胞、成黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞三個階段。黑素細(xì)胞的數(shù)量或功能異常, 將會引起許多色素性皮膚病, 如白癜風(fēng)或黃褐斑等。在研究白癜風(fēng)氧化應(yīng)激的實驗中，研究者多把不同濃度的中藥加入到H2O2處理的黑素細(xì)胞培養(yǎng)中，觀察中藥在體外對白癜風(fēng)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所起的干預(yù)作用。

銀杏葉提取物是一種廣泛應(yīng)用的天然藥物。目前國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物是按德國Schwabe專利工藝生產(chǎn)的EGb761，它是從銀杏葉中經(jīng)多個步驟分離、純化而提取出的一種標(biāo)準(zhǔn)化的銀杏葉提取物制劑，其中包含24%銀杏黃酮苷類和6%銀杏萜內(nèi)酯類成分。Scholtyssek等[4]證實銀杏葉提取物中的銀杏糖苷B、C、J和M及銀杏內(nèi)酯具有抗氧化的功能。Parsad等[5]將銀杏葉提取物用于治療局限型，進(jìn)展緩慢的白癜風(fēng)，研究結(jié)果顯示：治療組患者白斑區(qū)的擴(kuò)展較安慰劑組明顯減慢，甚至停止。并且25例患者中有10例患者經(jīng)銀杏葉提取液治療后，取得了顯著復(fù)色(>75%)或者完全復(fù)色。

我們前期實驗研究表明[2]，EGb761可以減輕β淀粉樣蛋白所致的海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)再生微環(huán)境，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞生長，從而對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮著較強(qiáng)的抗氧化作用。既然黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)細(xì)胞，且海馬神經(jīng)元也起源于神經(jīng)細(xì)胞，EGb761對海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用，那么，EGb761能否對黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷也起到保護(hù)作用呢？國外有學(xué)者[6]在臨床上應(yīng)用EGb761治療白癜風(fēng)獲得了一定的臨床療效，但EGb761治療白癜風(fēng)的具體作用機(jī)制尚不清楚，目前國內(nèi)外在EGb761對黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的生物學(xué)功能研究方面尚未見報道。我們通過以上研究，發(fā)現(xiàn)EGb761可以一定程度的提高黑素細(xì)胞的存活率，實驗結(jié)果表明EGb761可以改善氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，對抗黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，初步確定了銀杏葉提取物對白癜風(fēng)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，可以防治氧化應(yīng)激引起的白癜風(fēng)等黑素細(xì)胞相關(guān)疾病，從而為白癜風(fēng)的藥物防治提供新的實驗依據(jù)及研究思路。

[1] Le Bars PL, Velasco FM, Ferguson JM, et al. Influence of the severity of cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extract EGb761 in Alzheimer's disease[J]. Neuropsychobiology,2002,45(1):19-26.

[2] Xiao Q, Wang C, Li J, et al. Ginkgolide B protects hippocampal neurons from apoptosis induced by beta-amyloid 25-35 partly via up-regulation of brain-derived neurotrophic factor[J]. European Journal of Pharmacology,2010,12(647):48-54.

[3] 王濤，許愛娥.銀杏葉提取物EGb761神經(jīng)保護(hù)作用研究進(jìn)展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2010，36(2)：101-103.

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-09-27)

Effects of ginkgo biloba extract EGb761 on anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo

XIAOQian,CUITingting,GAOTianwen,WANGLin.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

Correspondingauthor:WANGLin,E-mail:wanglin@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effect of ginkgo biloba extract (EGb761) on the anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo. Methods: The normal human melanocyte cell line PIG1 was treated with H2O2firstly, followed by different concentrations (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL) of EGb761. The cell viability was measured by MTT. The levels of lipid peroxide metabolites such as malondialdehyde (MDA), lactic dehydrogenase (LDH) and GSH-Px were measured by biochemical methods. The level of cellular reactive oxygen species (ROS) was detected by flow cytometry. Results: Compared with control group, the expression levels of PIGI cell viability, SOD and GSH-Px were increased, and the expression levels of ROS, MDA and LDH were decreased in EGb761 group. Conclusion: EGb761 has a potential role in protecting melanocytes against H2O2-induced oxidative stress.

ginkgo biloba extract; vitiligo; oxidative stress

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

王琳，E-mail: wanglin@fmmu.edu.cn