曾凡杞 冉靈芝 胡鵬飛 劉鵠蔭

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·論著·

重組Ad-SOCS1介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞源外泌體對銀屑病樣小鼠模型的影響

曾凡杞 冉靈芝 胡鵬飛 劉鵠蔭

目的： 明確重組腺病毒(Ad-SOCS1)介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(DCs)分泌的外泌體對銀屑病樣小鼠模型的影響。方法： Ad-SOCS1腺病毒感染小鼠骨髓來源的DCs，分離純化培養(yǎng)物中的外泌體，Western blot分析鑒定外泌體中的CD63、SOCS1和ICAM-1蛋白。咪喹莫特(IMQ)誘導(dǎo)10只銀屑病樣小鼠模型，其中5只給予外分泌體治療(外分泌體組)組，5只作為對照(IMQ組)。RT-PCR檢測小鼠外周血IL-17A、IL-22和IL-23 mRNA的表達水平。結(jié)果： 外泌體中能夠鑒定到SOCS1、CD63和ICAM-1蛋白。外分泌體組小鼠的銀屑病樣表現(xiàn)較IMQ組輕。外分泌體組小鼠外周血IL-17A和IL-23 mRNA的表達低于IMQ組(P<0.01)，IL-22水平兩組間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論： Ad-SOCS1感染DC后培養(yǎng)物分離的外泌體可改善銀屑病的癥狀，其機制可能與外泌體SOCS1抑制IL-17A有關(guān)。

SOCS1； 銀屑病； 樹突狀細(xì)胞； 外泌體； IL-17A

銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發(fā)病率較高和主要累及青壯年等特點而在皮膚科臨床倍受重視。從病理學(xué)上看，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的異常、角質(zhì)層Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤是銀屑病的三個最主要的特點[1]。近年來許多研究表明白細(xì)胞介素(interleukin，IL)中IL-23/IL-17炎癥反應(yīng)軸在銀屑病皮損發(fā)展中起重要作用[2]。樹突狀細(xì)胞分泌的IL-23與受體結(jié)合后誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞17(T helper 17,Th17)活化并分泌IL-17、IL-22等多種細(xì)胞因子[3]，Th17細(xì)胞是IL-17家族細(xì)胞因子的主要來源，IL-17被認(rèn)為是建立和維持銀屑病表型的關(guān)鍵細(xì)胞因子[4]。目前治療銀屑病的藥物主要有維A酸類藥物、傳統(tǒng)免疫抑制劑以及新型免疫抑制劑，但這些藥物仍不能有效根治銀屑病，因此探索銀屑病新的治療方法或藥物非常必要。

細(xì)胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling1, SOCS1)是信號傳導(dǎo)通路JAK/STAT的一個負(fù)性調(diào)控分子，通過SH2結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞因子受體胞內(nèi)段與Janus激酶(Janus kinases,JAK)結(jié)合，泛素化后降解，從而阻滯干擾素(interferon，IFN)中的IFN-α、IFN-7、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15等多種因子信號，抑制樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)和其他細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT信號通路[5]。因此，SOCS1可能對銀屑病的治療具有一定的作用。前期我們利用腺病毒介導(dǎo)SOCS1治療銀屑病樣小鼠模型取得了一定療效，但腺病毒含有其他蛋白能刺激宿主產(chǎn)生中和抗體，影響再次使用。因此，探尋新的載體非常必要。

外泌體(exosome,Exo)是直徑約50～100 nm的小囊體，產(chǎn)生于血細(xì)胞或非血細(xì)胞的多囊體。含許多重要的生物活性分子，如MHC-I，MHC-II，CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和miRNAs，Exo靶向受體細(xì)胞的各種不同黏附分子起免疫調(diào)節(jié)作用[6]。此外，Exo因為其納米大小，較細(xì)胞穩(wěn)定，具有良好的生物依從性，是國際納米醫(yī)學(xué)研究的前沿和熱點，是天然的納米載體。研究表明IL-10處理不成熟的DCs獲得的Exo能夠抑制小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)和減少關(guān)節(jié)炎炎癥程度[7]。用表達FasL或IL-4的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs產(chǎn)生的Exo抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)炎癥，以MHC-II依賴而不是MHC-I依賴的機制能部分逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)炎[8,9]。該研究證明了通過外源基因修飾的DCs獲得的外泌體具有免疫抑制的功能。

在本研究中，用重組Ad-SOCS1病毒感染DCs后獲得的Exo治療用咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)銀屑病樣的小鼠模型，并研究其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 小鼠模型 Bal/C小鼠(雄性，18～20克，8周齡)購自廣東省實驗動物中心20只，分成對照組、IMQ組、IMQ+DCs-Exo-s組，每組5只，小鼠背部用脫毛機去毛2 cm×2 cm，對照組背部涂凡士林21 mg，1次/2 d,。其余兩組小鼠背部用含5% IMQ軟膏，劑量為62.5 mg涂抹，1次/2d，連續(xù)4次。同時IMQ+DCs-Exo-s組于IMQ涂抹后第2 d于皮損處以1.0 μg/kg劑量多點皮下注射，1次/2 d，連續(xù)4次。對照組和IMQ組用等量的PBS代替Exo。皮損的嚴(yán)重性用修正的人評分系統(tǒng)PASI分級評價[7]。累積得分的多少表明炎癥的嚴(yán)重性，得分越多表明炎癥越重。第8 d用斷頸方法處死小鼠，收集皮損標(biāo)本和血液標(biāo)本。所有動物的操作按照醫(yī)院倫理學(xué)委員會制定的指導(dǎo)手冊進行。

1.2 Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒的構(gòu)建和鑒定 Ad-SOCS1和Ad-EGFP重組病毒由本院中心實驗室保存，用Adeno-X Rapid Titer kit(BD Clontech)檢測病毒滴度。操作按BD Company試劑盒說明書進行。

1.3 小鼠DCs的培養(yǎng) 小鼠DCs的培養(yǎng)參照文獻[11]，具體如下。Bab/C小鼠(體重20～25 g，年齡4～6周)處死后在75%酒精中浸泡10 min，取后腿骨和脛骨，用無血清培養(yǎng)基沖洗骨髓后，用0.83%氯化銨破碎紅細(xì)胞，離心去上清，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，6 h后除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)在含rm-IL-4(10 ng/mL)、白血病抑制因子(LIF)(5 ng/mL)和rm-GM-CSF(10 ng/mL)的完全培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，加入重組Ad-SOCS1或Ad-EGFP病毒(感染復(fù)數(shù)為10)到DCs培養(yǎng)物中，48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。

1.4 Exo的分離純化和鑒定 Exo用梯度離心分離得到[7]，具體方法如下。被收集的培養(yǎng)上清液以300 g離心10 min,1200 g離心20 min,10 000 g離心30 min；上清液再以100 000 g超速離心1 h。Exo用生理鹽水洗滌，再以100 000 g超速離心1 h，以120 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，Exo蛋白濃度用微量Bradford蛋白實驗定量(Bio-Rad,CA)。每批用蛋白定量進行標(biāo)準(zhǔn)化，1 μg Exo蛋白溶解在20 μL PBS后用于小鼠體內(nèi)研究。分離后的Exo用電子顯微鏡鑒定其大小，用Western blot分析鑒定Exo中的蛋白，如CD63、ICAM-1和SOCS1。

1.5 Western blot分析Exo 用Western blot分析鑒定Exo。蛋白樣品用12% SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜到0.22 μm PVDF膜上。膜用含5%脫脂牛奶的TBST(10 mM Tri-HCL，150 mM NaCl，0.25% Tween-20,pH 7.5)室溫下封閉1 h，然后加入一抗孵育過夜。一抗是兔抗小鼠多克隆抗體SOCS1(Santa Cruz)、抗-ICAM-1、HSP70(所有一抗以1∶1000稀釋)，用TBST洗滌后，膜在室溫下與羊抗兔的IgG-HRP二抗孵育1 h,用加強的化學(xué)熒光(ECL)顯色。

1.6 外周血細(xì)胞因子的檢測 外周血細(xì)胞因子的濃度用Th1/Th2/Th17 CBA試劑盒(BD Pharmingen,USA)檢測。

1.7 病理分析 石蠟包埋的皮損組織用冰凍切片機制成4 μL薄片，按照常規(guī)的病理進行H&E染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察皮損的病理變化。

1.8 實時定量RT-PCR 用TRIzol試劑盒(Invitrogen,USA)從皮損提取總RNA，用NucleoSpin RNA試劑盒(Macherey-Nagel,Germany)純化。用AcDNA合成試劑盒(Agilent Technologies,USA)和特異引物產(chǎn)生互補cDNA，用實時定量RT-PCR檢測基因的相對表達水平(Roche,USA)。與β-Actin比較進行歸一化處理，mRNA的表達用相對倍數(shù)表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SSPS 17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗比較兩組之間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC和DC來源的Exo的鑒定 以前我們已證明Ad-SOCS1感染DCs表達SOCS1[10]。由于未成熟的DCs具有免疫抑制功能，我們在培養(yǎng)DCs的過程中加入LIF、IL-4，一方面促進DCs的培養(yǎng)，另一方面抑制DCs的成熟。透射電鏡觀察顯示自DCs培養(yǎng)物分離純化的Exo直徑為50 nm左右，Western blotting分析表明Exo含SOCS1、CD63和ICAM-1蛋白,而沒有感染Ad-SOCS1的DCs細(xì)胞獲得的Exo含SOCS1蛋白較少Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒感染的DCs來源的Exo均含CD63、ICAM-1蛋白。這些結(jié)果表明我們成功地從Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒感染DCs后培養(yǎng)物中分離和純化了Exo,Ad-SOCS1感染DCs后培養(yǎng)物的Exo中含SOCS1蛋白(圖1)。

a：用透射電鏡觀察Exo；b：Western blot分析Ad-SOCS1感染和未感染的DC分離的Exo中蛋白CD63、ICAM-1和SOCS1。

圖1 DC培養(yǎng)物分離純化的Exo的鑒定

2.2 Exo對銀屑病樣小鼠模型的治療觀察 從圖2可以看出對照組皮損無鱗屑、無增厚，呈正常皮膚外觀。IMQ組從第2 d開始出現(xiàn)紅斑、皺褶，并隨著時間的推移皮損加重，至8 d皮損深紅，大量的鱗屑，呈層狀增厚，鱗屑脫落可見點狀出血，呈典型銀屑病樣外觀。IMQ+DCs-Exo-s組可見少許紅斑、鱗屑，皮膚輕度增厚。我們采用修正的PASI評分系統(tǒng)對小鼠皮損進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組在PASI總分、紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度方面具有顯著差異(P<0.05)，見表1。H&E染色結(jié)果表明對照組皮膚薄，細(xì)胞形態(tài)正常，IMQ組的皮損棘細(xì)胞角化不全，棘層肥厚，有延長

的“網(wǎng)狀”背脊，真皮淺層血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)銀屑病樣的典型表型，但IMQ+DCs-Exo-s組顯著減少表皮層厚度，減輕IMQ誘導(dǎo)的銀屑病。病理分析進一步支持DCs-Exo-s能夠改善角質(zhì)形成細(xì)胞角化，顆粒層增加，棘層減少，真皮淺層血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤減少(圖3)。這些結(jié)果表明Ad-SOCS1感染的DC來源的Exo對銀屑病樣的小鼠模型皮損有顯著的改善作用。

表1 不同處理對IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型后第7 d的得分、鱗屑、厚度和紅斑指標(biāo)

注：與對照組比較，*P<0.01；與IMQ組比較，#P<0.05

圖2 不同處理的皮膚表觀

a:對照組;b:IMQ組;c:IMQ+DCs-Exo-s組

圖3 Exo治療IMQ誘導(dǎo)小鼠的銀屑病樣組織的病理分析(HE，×100)

2.3 外周血細(xì)胞因子水平的檢測 與對照組比較，IMQ組小鼠外周血中IL-17A、IL-10、IL-4、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平分別提高5.1、9.0、8.3、6.5、6.1、3.6和3.3倍。與對照組比較DCs-Exo-s組外周血中IL-17A、IL-10、IL-4、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平分別為2.8、6.4、5.3、2.8、3.0、1.3和1.4。這些結(jié)果表明IMQ的反復(fù)涂抹小鼠皮膚能夠激活免疫系統(tǒng)，而Ad-SOCS1感染DCs的Exo能夠抑制IMQ誘導(dǎo)的免疫激活(表2)。

2.4 皮損組織中IL-17A、IL-22和IL-23 mRNA的表達 為了更清楚研究Exo的作用，我們根據(jù)前面的實驗，用RT-PCR分析比較對照組、IMQ組和IMQ+DCs-Exo-s組小鼠皮損中IL-17A、IL-22和IL-23的表達。結(jié)果表明DCs-Exo-s能顯著抑制IL-17A和IL-23的表達，各處理組對IL-22的表達沒有明顯差異(P>0.05)，見圖4。

表2 IMQ組和IMQ+DCs-Exo-s組細(xì)胞因子水平較對照組提高的倍數(shù)

與同組對照組和IMQ+DCs-Exo-s組比較，*P<0.01

3 討論

SOCS1是各種不同細(xì)胞因子刺激細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)的負(fù)反饋因子，為JAK/Stat信號途徑中JaK激酶的假底物，從而抑制JAK/Stat信號途徑。DCs細(xì)胞在先天免疫和獲得性免疫中處于中心地位，由不同的亞群組成，不同亞群所起的作用也不完全相同。臨床上一般從外周血分離的單個核細(xì)胞在IL-4/Flt3和rm-GM-CSF誘導(dǎo)成未成熟的DCs，用抗原脈沖，用LPS或TNF-α使DCs成熟制備DCs細(xì)胞疫苗，用于腫瘤或病毒的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的DCs表明具有免疫抑制功能，對自身免疫性疾病具有一定的治療作用。但是，體外培養(yǎng)的DCs難以保存。研究表明DCs或Tregs分泌的Exo與其母體一樣具有免疫調(diào)節(jié)作用，主要因為Exo含有各種生物活性分子，如mRNA、microRNA、lncRNA、酶和蛋白質(zhì)等[12]。在本研究中，我們從未成熟的DCs培養(yǎng)物中通過多次離心獲得了Exo，其直徑約50 nm,用Western blotting分析證明了這些Exo含CD63和ICAM-1特征性標(biāo)記物。Ad-SOCS1感染的DC培養(yǎng)物Exo中含SOCS1蛋白。含生物活性的Exo被細(xì)胞攝取后，生物活性分子在受體細(xì)胞中發(fā)揮其功能。

用IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型能模擬人類銀屑病，包括紅斑、過度角化、鱗屑、表皮中性粒細(xì)胞的微膿瘍和真皮淺層血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，是研究銀屑病較為理想的模型[7]。在本研究中，我們研究了表達SOCS1的腺病毒感染樹突狀細(xì)胞后獲得的Exo，能顯著改善角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎性細(xì)胞浸潤，抑制Th17細(xì)胞分化和IL-17A的分泌，這可能與Ad-SOCS1感染DC細(xì)胞后獲得的Exo中含SOCS1蛋白有關(guān)，因為Ad-SOCS1感染的DCs來源的Exo對銀屑病樣小鼠模型的表觀改善更為顯著，更能抑制IL-17A的分泌。因此，Ad-SOCS1感染DCs獲得的Exo能抑制Th17/IL17信號軸。盡管Th1細(xì)胞是銀屑病的主要細(xì)胞類型，但目前認(rèn)為Th17/IL-23在銀屑病免疫致病中起關(guān)鍵作用[12]。而IL-23是推動初始T細(xì)胞分化成Th17的關(guān)鍵細(xì)胞因子，是架設(shè)先天性免疫和獲得性免疫所必需的細(xì)胞因子，并啟動早期局部免疫反應(yīng)；IL-23結(jié)合受體后可激活JAK-STAT3信號途徑，有研究表明在銀屑病患者皮損及外周血IL-23的mRNA和分子水平均有較高水平表達[14，15]，在本研究中，IMQ組皮損中IL-23的mRNA顯著升高(P<0.01),IMQ+DCs-Exo-s組皮損中IL-23的mRNA較IMQ組顯著降低(P<0.01),但仍高于對照(P<0.05)。因此，我們推斷并支持IL-23在銀屑病的致病機制中起主要作用，靶向IL-23的藥物(如Tildrakizumab和Guselkumab)有助于治療銀屑病[16]。Th17細(xì)胞與各種自身免疫病和炎癥性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、實驗自身免疫腦膜炎)相關(guān)[17]。IL-23是從初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-6誘導(dǎo)下分化和維持致病Th17關(guān)鍵的上游細(xì)胞因子。DCs和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-23結(jié)合到被激活的Th17細(xì)胞上的IL-23受體，強化極化的Th17主要轉(zhuǎn)錄因子-孤兒核受體c-t(orphan nuclear receptor c-t,RORc-t)的表達。RORc-t和IL-6相互作用共同誘導(dǎo)STAT3信號刺激效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22的產(chǎn)生[18，19]。在本研究中，源自Ad-SOCS1感染的DCs后分泌的Exo能減少皮損和外周血中的IL-17A的表達，可能直接減少CD4+IL-17A細(xì)胞的百分比，抑制IL-17A的表達，表明Ad-SOCS1感染的DCs后分泌的Exo不僅能抑制Th17細(xì)胞分化而且抑制Th17細(xì)胞功能。Th17細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子TNF-α，該細(xì)胞因子被認(rèn)為是銀屑病治療的重要靶點[20，21]。在IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中，DCs后分泌的Exo減少TNF-α的表達，而且減少Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的表達。此外，DCs后分泌的Exo抑制IMQ誘導(dǎo)的IL-10表達。我們推測增加IL-4表達保護Th1/Th2平衡，IL-10表達增加前炎癥細(xì)胞因子的分泌，因而抑制銀屑病樣小鼠模型的Th17/Treg平衡。因為DCs后分泌的Exo抑制IL-17A，IL-10的表達。

總之，我們證明了Ad-SOCS1感染DCs后分泌的Exo通過抑制Th17細(xì)胞的分化和IL-17A的分泌減輕IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣炎癥。該結(jié)果表明Ad-SOCS1感染DCs后分泌的Exo能作為抑制銀屑病局部炎癥的潛在制劑。

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(收稿：2017-01-08 修回：2017-03-09)

Effects of Ad-SOCS1 infected DCs-secreted exosome on the therapy of psoriasis-like murine models

ZENGFanqi,RANLingzhi,HUPengfei,LIUHuyin.

ShenzhenGuangmingNewDistrictPeople'sHospital518106,Guangdong,China

Correspondingauthor:ZENGFanqi,E-mail:zeng-2005@126.com

Objective: To determine the effect of exosome derived from the dendritic cells (DCs) induced by Adenovirus-Suppressor of cytokine signaling1 (Ad-SOCS1) on the psoriasis-like murine models. Methods: The exosomes of murine DCs were infected by Ad-SOCS1. The levels of SOCS1, CD63 and ICAM-1 from exosome were detected by Western Blot. The psoriasis-like murine models were induced by imiquimod (IMQ) and were divided into the DC-exo(s) group and IMQ-group. The mRNA levels of IL-17A, IL-22 and IL-23 in peripheral blood were detected by RT-PCR. Results: SOCS1, ICAM-1 and CD63 proteins in exosomes were detected. The symptoms of the psoriasis-like mouse in the DC-exo(s) group were better than that in the control group. The level of IL-17A and IL-23 mRNA were higher in the DC-exo-S group than that in the control group. There was no significant difference in the IL-22 level between the DC-exo-S group and control group. Conclusion: Exosome from Ad-SOCS1-infected DCs culture can improve the psoriasis-like murine models. The mechanisms may be associated with the inhibition of IL-17A and IL-23.

suppressor of cytokine signaling1 (SOCS1); psoriasis, dendritic cells (DCs); exosome; IL-17A

深圳市科技計劃項目(編號：201103214)

深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳,518106

曾凡杞，E-mail：zeng-2005@126.com