顧紅梅 邵陽(yáng)

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急性腦梗死患者TLR4/NF-κB信號(hào)通路水平與腦血流量的相關(guān)性研究

顧紅梅 邵陽(yáng)

目的 評(píng)價(jià)急性腦梗死患者血清中toll 樣受體4(TLR4)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號(hào)通路水平與腦血流量的相關(guān)性。方法 選取在本院接受治療的100例大腦中動(dòng)脈(MCA)供血區(qū)域腦梗死患者作為試驗(yàn)組，再選取同期接受體檢健康的100例正常人作為對(duì)照組，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)2組患者的TLR4和NF-κB水平，分析2組研究對(duì)象的大腦前動(dòng)脈(ACA)、MCA收縮期血流峰值與TLR4、NF-κB的相關(guān)性。結(jié)果 試驗(yàn)組ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于對(duì)照組(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而試驗(yàn)組MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于對(duì)照組(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)。試驗(yàn)組TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于對(duì)照組TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)；TLR4及NF-κB水平與ACA血流速度呈正相關(guān)，與MCA血流速度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 急性腦梗死患者M(jìn)CA、ACA血流峰值與TLR4及NF-κB水平存在相關(guān)性。

急性腦梗死 toll樣受體4(TLR4) 核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)

Toll樣受體家族(toll like receptors, TLRs)在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中炎癥介質(zhì)和炎癥應(yīng)答的產(chǎn)生起到重要作用，其中TLR4的研究最為深入[1]。核因子-κB(NF-κB)作為最重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，參與了諸多炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理和病理過(guò)程，NF-κB的活化及移位導(dǎo)致TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游多種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，是TLR4反應(yīng)通路中關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[2]。大量研究已經(jīng)指出TLR4/NF-κB信號(hào)通路在腦梗死患者發(fā)病過(guò)程中存在的意義與影響，對(duì)于其早期診斷的意義十分重大，但具體的作用方式仍處于爭(zhēng)議狀態(tài)[3-4]，Song[5]認(rèn)為T(mén)LR4/NF-κB損傷血管內(nèi)皮導(dǎo)致血流量下降可能是主要原因。為進(jìn)一步明確TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子水平對(duì)急性腦梗死患者腦血流量的影響，本研究選取部分患者與健康人群進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年12月～2015年12月在本院接受治療的急性腦梗死患者作為試驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均以第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議中的《各項(xiàng)腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)》為診斷依據(jù)[5]，以頭顱MRI和MRA為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，確診為大腦中動(dòng)脈(MCA)供血區(qū)域腦梗死患者；所有患者均自愿參與調(diào)查研究，且患者均在發(fā)病24～48 h內(nèi)；至醫(yī)院行TCD、CT檢查均證實(shí)為腦梗死的患者；不存在其他心理疾病的患者，且所有患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有顱內(nèi)感染、神經(jīng)精神疾患、身體衰弱、顱內(nèi)占位性病變、脊髓病變、中毒等患者；入院前患有嚴(yán)重的代謝性疾病或是內(nèi)科疾病，同時(shí)包括服用一些藥物而影響免疫功能的患者；病程相對(duì)較長(zhǎng)，不屬于急性發(fā)作的患者。符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者100例，再選取同期接受體檢健康的100例正常人作為對(duì)照組。2組的年齡、性別等比較無(wú)明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 2組人口學(xué)和病史比較

1.2 方法

1.2.1 TLR4/NF-κB水平測(cè)定

首先在患者進(jìn)行標(biāo)本采集前6 h禁食和飲水，并在血液標(biāo)本采集當(dāng)天清晨空腹情況下采集肘部靜脈血8 mL，其中肝素抗凝管中取6 mL血液標(biāo)本，混合均勻；采用Ficoll液體分層法將血液分離提純后取其單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，其余2 mL靜脈血標(biāo)本放入不含抗凝劑的試管中，在溫室環(huán)境中放置，待其凝固后分離得到血清，于20℃環(huán)境下進(jìn)行冷凍保存；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳及半定量技術(shù)對(duì)TLR4實(shí)施檢測(cè)；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)NF-κB水平進(jìn)行檢測(cè)[6-7]。

1.2.2 經(jīng)顱彩色多普勒血流顯像(CDFI)檢查

兩組采用德國(guó)西門(mén)子ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀，探頭型號(hào)4V1c，頻率2.0 MHz；將探頭置于顳窗檢測(cè)大腦前動(dòng)脈(ACA)與MCA血流情況，記錄3次平均血流速度，每次2 min，取3次的平均值作為腦血流速度的測(cè)定值，所有檢查均由本科同一名高年資影像學(xué)醫(yī)師進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者的收縮期峰值情況

試驗(yàn)組ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于對(duì)照組(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而試驗(yàn)組MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于對(duì)照組(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)(表1)。

表1 2組患者的收縮期峰值比較,cm/s]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 2組TLR4及NF-κB水平比較

試驗(yàn)組TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于對(duì)照組TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)(表2)。

2.3 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析表明，TLR4及NF-κB水平與ACA血流速度呈正相關(guān)(r=0.448、0.531，P<0.05)，與MCA血流速度呈負(fù)相關(guān)((r=-0.502、-0.403，P<0.05)(表3)。

表2 2組TLR4及NF-KB水平比較，ng/mL]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表3 TLR4及NF-κB水平與ACA及MCA血流速度的相關(guān)性分析

3 討 論

近幾年來(lái)腦梗死的發(fā)病人數(shù)不斷增多，且多數(shù)患者為急性發(fā)病，致殘率與致死率均較高，如若不能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期進(jìn)行治療會(huì)對(duì)機(jī)體造成永久性的不可逆性傷害。急性腦梗死患者的發(fā)病原因不一，大多數(shù)患者腦梗死的急性發(fā)病均與含有細(xì)胞參與的急性炎癥反應(yīng)以及與患者機(jī)體發(fā)生缺血再灌注所遭受的血管損傷有十分密切的關(guān)系[8]。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLRS，位于9q32-33，除可在單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)，還可在母嬰界面廣泛表達(dá)，它可同時(shí)識(shí)別外源性配體如脂多糖(LPS)及內(nèi)源性配體如高遷移率族蛋白1等，Toll/IL-1受體(TIR)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄的起始部位，主要是通過(guò)髓樣分化因子MyD88依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和NF-κB激活細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有廣泛表達(dá)，且細(xì)胞載體一般為小膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型，一旦患者腦組織中出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，TLR4將被激活并發(fā)揮較強(qiáng)的抑制炎癥反應(yīng)的作用，因此其是小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫執(zhí)行過(guò)程中的一種關(guān)鍵信號(hào)之一[9-10]。不僅如此，TLR4在機(jī)體的腦血管細(xì)胞中其內(nèi)皮細(xì)胞表面、脈絡(luò)叢、終板等也存在一定程度的表達(dá)。在急性腦梗死發(fā)病后腦組織中血液循環(huán)狀態(tài)差，且氧氣供應(yīng)不足，導(dǎo)致腦血管中內(nèi)皮部分通透性發(fā)生改變，使腦組織中的壞死物質(zhì)得到了釋放，并且吸引淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等凝集，進(jìn)而促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這幾種細(xì)胞均能使TLR4得到充分的表達(dá)[11-12]。TLR4作為一種十分重要的炎性受體類(lèi)型，能夠?qū)C(jī)體炎性損傷進(jìn)行介導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有啟動(dòng)的作用，并且通過(guò)核因子(NF-κB)等途徑激活炎癥細(xì)胞，對(duì)粘性因子與炎性因子產(chǎn)生作用，使其得到大量的表達(dá)，促發(fā)機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)[13]。同時(shí)，TLR4也是腦缺血后產(chǎn)生炎性損傷的效應(yīng)分子類(lèi)型，本研究中急性腦梗死發(fā)病后的患者TLR4水平比正常人明顯增多，同時(shí)血流量明顯下降；Wang[14]推測(cè)其機(jī)制可能是血管內(nèi)皮損傷時(shí)血小板表達(dá)CD34+增加，TLZR、TL4R信號(hào)途徑與P3I K/Akt信號(hào)通路相互交聯(lián)，通過(guò)GSK-3β和mTOR下游信號(hào)通路與C反應(yīng)蛋白(CRP)相互作用，促使血管內(nèi)皮損害進(jìn)一步加重，促使動(dòng)脈結(jié)構(gòu)變化、動(dòng)脈纖維化和動(dòng)脈僵硬，致病變區(qū)域MCA血流峰速下降，而ACA血流上升屬于代償性現(xiàn)象。

急性腦梗死患者的機(jī)體中NF-κB發(fā)生活化反應(yīng)，可以作為T(mén)NF-α等多種不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活因子，是大腦組織中多種信號(hào)通路的一個(gè)聚集點(diǎn)，通過(guò)對(duì)各種物質(zhì)或因子轉(zhuǎn)錄過(guò)程中水平的調(diào)節(jié)來(lái)控制轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮臨床作用[15-16]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，已經(jīng)明確細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)與NF-κB之間存在較大的聯(lián)系，幾種物質(zhì)共同參與腦梗死急性發(fā)病的過(guò)程[17]。相關(guān)研究進(jìn)一步表明，細(xì)胞因子的啟動(dòng)含有2個(gè)NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，當(dāng)腦梗死發(fā)生時(shí)患者的轉(zhuǎn)錄因子被激活，NF-κB水平增加，導(dǎo)致腦組織中部分細(xì)胞發(fā)生異常變化，致使患者動(dòng)脈血管內(nèi)皮受損，最終發(fā)展成為腦血管閉塞，腦組織血流灌注減少至消失，缺血缺氧程度加重等[18]，但也有學(xué)者認(rèn)為血流量下降才是NF-κB激發(fā)的始動(dòng)因素[19]，兩者的因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，急性腦梗死患者M(jìn)CA、ACA血流峰值與TLR4及NF-κB水平存在相關(guān)性，但兩者的因果關(guān)系需要更多研究證實(shí)。

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(2016-10-18收稿)

The relation of TLR4/NF-κB cytokines signaling pathway and cerebral blood flow in patients with acute cerebral infarction

Gu Hongmei, Shao Yang.

Department Of Neurology, The second Hospital Affiliated Nanjing Medical University, Nanjing 215002

Objective To evaluate the correlation between the serum toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear transcription factor (NF-κB) signaling pathway factor levels and cerebral blood flow in acute cerebral infarction patients.Methods 100 middle cerebral artery(MCA) obstruction cerebral infarction patients (the test group) were selected in our hospital. And then 100 normal healthy cases(the control group) were chosen. The level of TLR4 and NF-κB were detected by using the immunohistochemical. The correlation between the systolic peak in anterior cerebral artery(ACA), MCA and TLR4, NF-κB were analyzed in two groups.Results The ACA peak flow (55.54±4.22) cm/s was higher in the test group than that (48.65±3.54) cm/s in the control group (t=9.145,P<0.001), while the MCA peak flow (132.45±5.65) cm/s were lower in the test group than that (141.54±3.54) cm/s in the control group (t=8.436,P<0.001). TLR4 and NF-κB levels (4.29±0.46) ng/mL, (144.43±23.67) ng/mL were higher in the test group than those TLR4 (3.65±0.57) ng/mL and NF-κB (115.63±24.45) ng/mL in the control group (t=5.861, 5.677,P=0.012, 0.0018). TLR4 and NF-κB levels were positively correlated with ACA blood flow velocity, negatively correlated with MCA flow velocity (P<0.05).Conclusion There was a correlation between MCA, ACA peak flow and TLR4, NF-κB level in patients with acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction Toll-like receptor 4 (TLR4) Nuclear factor KB (NF-κB)

210000 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[顧紅梅 邵陽(yáng)(通信作者)]

R743.32

A

1007-0478(2017)03-0197-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.007