姜宏佺 豐宏林 孫曉嘉

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·論 著·

胍那芐對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型具有保護(hù)作用

姜宏佺 豐宏林 孫曉嘉

目的 探討P-eIF2α去磷酸化抑制劑胍那芐(guanabenz，GA)對(duì)胚胎小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣雜交細(xì)胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型是否具有保護(hù)作用及是否能夠減少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。方法 (1)應(yīng)用依霉素(Tunicamycin，TM)作用到鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣雜交細(xì)胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)，獲得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ERS模型；再給予不同濃度的GA通過顯微鏡及MTT方法觀察GA對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ERS模型細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活力的影響；用Western Blot方法檢測(cè)TM、GA對(duì)NSC34細(xì)胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影響；(2)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法制作SOD1 G93A NSC34穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過Western blot方法檢測(cè)GA對(duì)外源性SOD1 G93A蛋白以及內(nèi)源性mouse SOD1蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果 (1)在NSC34的ERS模型中多個(gè)濃度的GA與對(duì)照組比較可以顯著增加細(xì)胞數(shù)量，提高細(xì)胞活力(P<0.05)；GA可以增加ERS相關(guān)蛋白P-eIF2α的表達(dá)量；(2)GA在SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系中能夠減少外源性hSOD1蛋白的表達(dá)量，而對(duì)內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白表達(dá)量沒有明顯影響。結(jié)論 (1)GA可能通過增加P-eIF2α的表達(dá)量而對(duì)NSC34細(xì)胞系的ERS模型具有保護(hù)作用；(2)GA在SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系中可以減少外源性hSOD1蛋白的表達(dá)量。

神經(jīng)系統(tǒng)變性病 肌萎縮側(cè)索硬化 胍那芐 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 SOD1

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)又稱Charcot病或Lou Gehrig病，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，以脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核和錐體束同時(shí)受累，以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害并存為特征，致使隨意運(yùn)動(dòng)逐漸喪失、呼吸肌麻痹或合并呼吸道感染而最終死亡，平均病程3～5年[1]。ALS是一個(gè)多因素作用的疾病，它的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與SOD1基因突變、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、膠質(zhì)細(xì)胞病變、自噬、免疫炎癥等機(jī)制有關(guān)[2-3]。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)逐漸成為ALS研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4-6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)胍那芐(guanabenz，GA)作為P-eIF2α去磷酸化抑制劑，可以延長(zhǎng)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期，延緩發(fā)病時(shí)間及運(yùn)動(dòng)功能減退[7]。Wang等[8]人的研究也得到類似的研究結(jié)果。GA在ALS細(xì)胞水平上的研究尚未見報(bào)道。

鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣雜交細(xì)胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)是胚胎小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤雜交而形成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞系，它同時(shí)具有了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特征如動(dòng)作電位的產(chǎn)生、乙酰膽堿的分泌、軸突的延伸等；又擁有腫瘤細(xì)胞可以傳代的特征[9]，是目前研究運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元最好的細(xì)胞模型之一[10]。衣霉素(Tunicamycin，TM)是一種細(xì)菌和真核生物N-乙酞胺基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，能夠阻止N-乙酞胺基葡萄糖脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的形成和新合成糖蛋白的糖基化，引起錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，從而誘發(fā)ERS[11]。本研究旨在探討GA對(duì)NSC34細(xì)胞系的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型是否具有保護(hù)作用及是否能夠減少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器

NSC34細(xì)胞系購(gòu)于加拿大CEDARLANE Corporation；Anti-eIF2α(CST公司， 美國(guó))； Anti-P-eIF2α(CST公司， 美國(guó))；Anti-SOD1(北京博奧森公司，中國(guó))；依霉素(sigma公司，美國(guó))；胍那芐(sigma公司，美國(guó))；MTT粉末(sigma公司，美國(guó))；DMEM(Sigma公司，美國(guó))；Anti-actin(Santa Cruz公司，美國(guó))；96孔板(corning，美國(guó))；二氧化碳培養(yǎng)箱 (Verco 公司，美國(guó))；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；紫外分光光度計(jì)Nanodrop(Thermo公司，美國(guó))；Odyssey紅外熒光掃描儀(LICOR，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和ERS模型建立

NSC34細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液；傳代時(shí)用0.25%胰酶消化1 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同濃度TM對(duì)NSC34細(xì)胞系細(xì)胞活力影響的不同，我們選擇TM 2.5 mg/mL作用到NSC34細(xì)胞系，構(gòu)建運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ERS模型，再加入GA(5.0 μM)，觀察GA對(duì)NSC34細(xì)胞系的ERS模型是否具有保護(hù)作用。

1.2.2 細(xì)胞分組

NSC34細(xì)胞分為衣霉素NSC34空白對(duì)照組(Vehicle組)、TM(Tunicamycin)組和TM+GA組；TM組：NSC34細(xì)胞均勻鋪板后24 h加入不同濃度TM，濃度為0.5、1.25、2.5、5、10 μM，在24hMTT檢測(cè)細(xì)胞活力；TM+GA組：NSC34細(xì)胞均勻鋪板后24 h加入TM，終濃度為2.5 μM，同時(shí)加入不同濃度的GA，終濃度為0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、12.5、25 μM，24 h后MTT檢測(cè)細(xì)胞活力。

hSOD1 G93A NSC34細(xì)胞系對(duì)照組和hSOD1 G93A NSC34細(xì)胞系+GA組，24 h后用Western blot方法檢測(cè)外源性SOD1 G93A蛋白以及內(nèi)源性mouse SOD1蛋白表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)

首先稱取適量MTT粉末，應(yīng)用PBS對(duì)其進(jìn)行溶解，配制成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，用1.5 mL離心管分裝，避光-20 ℃保存?zhèn)溆茫淮龣z測(cè)96孔板中貼壁細(xì)胞活力時(shí)每孔加入20 μL MTT溶液，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔及對(duì)照孔，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體；每孔加入150 μL DMSO，避光條件下輕微振蕩10 min；通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)量各孔的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞活力。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=[A(加藥孔)-A(調(diào)零孔)]/[A(對(duì)照孔)-A(調(diào)零孔)]×100%

1.2.4 Western Blot檢測(cè)

棄掉培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液，使用預(yù)冷的0.01 M PBS洗滌細(xì)胞3次，加100 μL的裂解液，冰上裂解30 min；在冰上用細(xì)胞刮迅速刮下培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，用移液器將細(xì)胞裂解懸液移至1.5 mL離心管中，渦旋數(shù)秒鐘，12 000 r/min 4 ℃離心20 min；吸取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度；10%SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA中37 ℃搖床封閉2 h；將硝酸纖維素膜放入Anti -eIF2α(1∶1 000)抗體、Anti-P-eIF2α(1∶1 000)抗體、Anti-actin(1∶1 000)抗體、Anti-SOD1抗體(1∶200) 的一抗溶液中，4 ℃過夜；PBST洗膜后置于相應(yīng)種屬的紅外二抗中(1∶8 000)，避光室溫?fù)u床孵育1 h；用PBST漂洗膜10 min×3次后用Odyssey掃膜儀掃膜，并應(yīng)用Image J軟件分析條帶的光密度值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。各種檢驗(yàn)的顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GA對(duì)NSC34細(xì)胞系ERS模型的影響

2.1.1 不同濃度TM對(duì)NSC34細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響

不同濃度TM對(duì)該細(xì)胞都有一定的損傷作用(P<0.05)，但是不同濃度對(duì)細(xì)胞活力的影響并不明顯(P>0.05)(圖1)。

圖1 TM作用NSC34細(xì)胞24h后對(duì)細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

2.1.2 顯微鏡下觀察GA對(duì)TM作用到NSC34細(xì)胞系24 h細(xì)胞數(shù)的影響

通過顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)TM+GA組細(xì)胞數(shù)較TM對(duì)照組增多(圖2)。

2.1.3 MTT方法檢測(cè)GA對(duì)NSC34細(xì)胞系ERS模型細(xì)胞活力的影響

多個(gè)濃度GA對(duì)TM在NSC34細(xì)胞系中所致的ERS模型具有明顯的保護(hù)作用，可以提高細(xì)胞活力(P<0.05)(圖3)。

圖2 顯微鏡下觀察GA對(duì)TM作用24h細(xì)胞數(shù)量的影響 TM+GA組細(xì)胞數(shù)較TM對(duì)照組增多(scalebar=200μm)

圖3 GA與TM共同作用24h細(xì)胞活力的變化 與空白對(duì)照組、TM+GA0.25μm組及TM+GA0.75μm組比較,*P<0.05

2.1.4 用Western Blot方法檢測(cè)TM、GA對(duì)NSC34細(xì)胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影響

TM組與對(duì)照組比較，P-eIF2α表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，證實(shí)TM可以成功誘導(dǎo)NSC34的ERS模型，而TM+GA組與TM組比較發(fā)現(xiàn)，GA能夠增加P-eIF2α的表達(dá)量(P<0.05)，但并不影響總eIF2α的含量(P>0.05)(圖4)。

2.2 GA對(duì)SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系SOD1蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系

通過慢病毒(Lentiviral)載體攜帶 Puromycin與 GFP 共表達(dá)；通過加嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選。成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系(圖5)。

圖4 TM、GA對(duì)NSC34細(xì)胞系ERS相關(guān)蛋白P-eIF2α的影響 A為Vehicle組、TM組、TM+GA組ERS相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化;B為對(duì)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)量比較,與TM組P-eIF2α表達(dá)量比較,*P<0.05

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1G93ANSC34細(xì)胞系GFP熒光圖片(scalebar=200μm)

2.2.2 GA在SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系中可以減少外源性mSOD1蛋白的表達(dá)量

GA主要減少外源性SOD1 G93A蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白表達(dá)沒有明顯影響(P>0.05)(圖6)。

3 討 論

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，它的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與SOD1基因突變等機(jī)制有關(guān)。近年來越來越多的研究表明ERS參與了ALS的發(fā)病機(jī)制，逐漸成為ALS研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[12]?；贓RS機(jī)制，通過抑制P-eIF2α的去磷酸化減輕ERS對(duì)ALS可能起到保護(hù)治療作用。胍那芐(guanabenz，GA)是一種中樞系統(tǒng)α-2受體激動(dòng)劑[13]，而最新研究發(fā)現(xiàn)它也是一種P-eIF2α去磷酸化抑制劑，它能夠選擇性的與PP1的亞基GADD34結(jié)合，抑制P-eIF2α去磷酸化，從而減少異常蛋白的合成，起到抑制ERS的作用[11]。GA只是抑制應(yīng)激狀態(tài)下蛋白質(zhì)的合成，對(duì)基本蛋白質(zhì)的合成沒有影響。

圖6 GA對(duì)外源性hSOD1G93A蛋白以及內(nèi)源性mouseSOD1蛋白表達(dá)量的影響 與Vehicle組比較,#P<0.05

NSC34細(xì)胞系是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞系，它同時(shí)具有了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特征和腫瘤細(xì)胞可以傳代的特征。TM可以引起錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，從而誘發(fā)ERS。本研究將TM加入到NSC34細(xì)胞系中可以明顯減少細(xì)胞數(shù)，引起ERS相關(guān)蛋白P-eIF2α表達(dá)量下降，成功制造出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ERS模型；在此基礎(chǔ)上再加入不同濃度的GA，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，研究結(jié)果顯示GA組細(xì)胞數(shù)較TM對(duì)照組明顯增多，GA可能通過增加P-eIF2α而對(duì)TM在NSC34細(xì)胞系中所致的ERS模型具有明顯的保護(hù)作用，可以明顯提高細(xì)胞活力。這與Tsaytler[11]等的研究結(jié)果一致，證明GA在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ERS模型中也可以起到保護(hù)作用。

mSOD1蛋白的異常沉積是造成ALS產(chǎn)生ERS的原因[14]，因此如果能夠減少mSOD1蛋白的表達(dá)量則可能起到抑制ERS的作用。本研究應(yīng)用慢病毒攜帶GFP轉(zhuǎn)染的方法成功制造了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系，它的轉(zhuǎn)染效率高，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比例高，因此是研究ALS理想的細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒是hSOD1 G93A，這與動(dòng)物模型一致。hSOD1 G93A蛋白的分子量為21 KD，而小鼠SOD1(mouse SOD1)分子量為17KD。本研究在SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系中加入GA(5 μM)，通過Western blot方法檢測(cè)到hSOD1 G93A蛋白的表達(dá)量明顯減少，而對(duì)內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白沒有影響。這說明GA只是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的異常蛋白起到抑制翻譯的作用，而對(duì)正常的基本功能蛋白沒有明顯的影響。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)胍那芐(guanabenz，GA)作為P-eIF2α去磷酸化抑制劑，可以延長(zhǎng)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期，延緩發(fā)病時(shí)間及運(yùn)動(dòng)功能減退。本研究以NSC34的ERS模型和SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系為ALS模型，研究GA對(duì)神經(jīng)元ERS模型以及ALS細(xì)胞模型的作用，本研究結(jié)果表明GA可能通過增加P-eIF2α的表達(dá)量而增強(qiáng)NSC34細(xì)胞ERS模型的細(xì)胞活力；在SOD1 G93A NSC34細(xì)胞系中可以減少外源性hSOD1 G93A的表達(dá)量。綜上所述，GA有可能成為治療ALS的新藥物。

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(2016-09-06收稿 2016-10-07修回)

Protective effect of guanabenz in endoplasmic reticulum stress model of mouse motor neuron-like hybrid cell line

Jiang Hongquan,Feng Honglin,Sun Xiaojia.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001

Objective To explore the protective effect of guanabenz(GA),a novel inhibitor of eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) dephosphorylation,in endoplasmic reticulum stress (ERS) model of mouse motor neuron-like hybrid cell line(NSC34),and determine whether it could decrease the expression of exogenous hSOD1 G93A protein.Methods (1) Tunicamycin (TM) was used to stress NSC34 to produce ERS model.We tested the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA by microscope and MTT test.The expression of phosphorylated-eIF2α (P-eIF2α) and eIF2α was detected by western blot in Vehicle,TM and TM+GA groups.( 2) hSOD1 G93A was transfected into NSC34 with lentiviral.The expression of hSOD1 G93A and mouse SOD1 was detected by Western blot in hSOD1 G93A NSC34 treated with or without GA.Results GA increased the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA compared with control group(P<0.05).Western blot results revealed that GA dramatically increased the level of P-eIF2α protein,without affecting total eIF2α protein level.The exogenous hSOD1 G93A protein was decreased by GA,but the expression of mouse endogenous SOD1 was not affected.Conclusion GA can protect the ERS model of NSC34 through increasing the expression of P-eIF2α protein.GA can decrease insoluble mutant SOD1 aggregates.

Neurodegenerative disease Amyotrophic lateral sclerosis Endoplasmic reticulum stress Guanabenz SOD1

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助(編號(hào)為12541472)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科疑難病科[姜宏佺 豐宏林(通信作者) 孫曉嘉]

R741

A

1007-0478(2017)03-0173-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.001